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1、第十章 微生物学培养检验技术 v 样品的采集 v采样:指从待检物中采取少量具代表性的样品供 分析检验用。 v一、采样要求 v1、采样前,准备好灭菌的容器及采样工具。 v2、无菌采样 v3、用无菌纸袋或玻璃器皿存放样品 v4、样品及时封口,并做好记录 v5、及时送检 v二、采集方法 v1、面包、糕点、方便食品 v采集方法:取原包装,用无菌镊子夹下包装 纸采取外部及中心部位检样共200g,带馅糕 点直接采取外皮与内陷25g。 v检样处理:无菌称检样25g,加入225ml无菌 生理盐水中制成菌悬液。 v2、豆制品 v样品采集:采取接触盛器边缘、底部及上面 不同部位样品200g放入灭菌容器内。 v检样
2、处理:无菌称样25g,放入225ml无菌水 中混匀。 3、乳及乳制品 (1)样品采集 散装或大型包装:用灭菌刀、勺取样,每件不少于 200g,及时送检。 大型包装:采用整件原包装,每件样品采集量为瓶 装:1瓶 袋装:1袋 罐装:1罐 (2)检样处理 鲜奶、酸奶:无菌手续去纸盖,瓶口火焰消毒后无 菌吸取25ml放入225ml无菌生理盐水中混匀。 炼乳:将瓶或罐用温水洗净,用点燃的酒精棉球消 毒,无菌开罐器开瓶后,无菌称25g(ml)放入225ml 无菌生理盐水中混匀。 v奶油:无菌开包,取适量于灭菌瓶 内,45水浴溶解(温箱),立即吸 25ml225ml生理盐水中十倍稀释( 45水溶中保温)。从
3、检样融化到接 种完毕不应超过30分钟。 v奶粉:罐装的同炼乳。袋装的用75%酒 精棉球涂擦消毒袋口,无菌开封取样 25g,放入含玻珠的瓶中,将225ml温 热生理盐水徐徐加入,防结块。 v奶酪:用灭菌刀削去部分表面封蜡, 再用点燃的酒精棉球消毒表面后,用 灭菌刀切开后,用无菌刀取表层及深 层检样少许,置灭菌乳钵内捣碎,加 少许生理盐水调成糊状。 v4、蛋及蛋制品 v(1)样品采集 v鲜蛋:用流水冲洗外壳,再用95%酒精棉球 涂擦消毒后,放入灭菌袋内,加封作好标记 送检。 v全蛋粉、蛋黄粉、蛋白片:将包装开口处用 75%酒精棉球消毒再开盖,用灭菌的金属制 双层螺旋式套管采样器斜角插入箱底,使套
4、管旋转收取检样,提出箱外用灭菌小匙自上 、中、下部取样,装入灭菌广口瓶中,每个 检样不少于100克。 v(2)检样处理鲜蛋外壳:用无菌生理盐 水浸湿的棉拭充分擦试蛋壳,将棉拭直接放 入培养基内增菌培养。 v将整只鲜蛋用无菌水擦洗,以擦洗液作检 样。 v鲜蛋蛋液:蛋壳流水下洗净75%酒精消毒 壳打蛋 v蛋粉:装样瓶浸入流动冷水中,检样融化后 取出放入有玻珠的瓶中。 v5、肉及肉制品 v 肉类包括鲜肉、冻肉、肉馅、禽肉等, 肉制品指火腿、香肠等。 v(1)样品采集 v生肉:宰后用无菌刀取两腿内侧肌肉各500 克或劈半后两侧背最长肌各50克,立即送检 。 v家禽:用灭菌棉拭采胸腹各10cm2,背10
5、cm2 ,四边各5cm2 v其他熟制品:一般采200克。 v(2)检样处理 v生肉:表面消毒(沸水内烫34秒或烧灼消 毒)无菌剪取检样深层肌肉25克灭菌乳 钵内剪碎无菌玻璃砂研磨加灭菌水 225ml v熟肉、灌肠、肉松:直接称25克放入灭菌乳 钵内无菌剪碎研磨加225ml无菌水 v棉拭液:凡用棉拭采取的检样作原液,摇匀 后10倍稀释 v6、调味品 v(1)样品采集 v酱油、食醋:瓶装 采取1瓶 v 散装 无菌吸500ml v酱类 用灭菌勺子取500g v味精 采取一袋100g v(2)检样处理 v瓶装:酒精棉球消毒瓶口石碳酸纱布盖 好灭菌开瓶器开启检验 v散装:直接吸取接种 v酱类:无菌称25
6、g225ml无菌水 v7、冷食品 (1)样品采集 v冷食菜:将样品混匀,采样200g v瓶装饮料:两瓶为一件 散装采500ml v冰淇凌:4杯为一件 散装采200g,放瓶内 冷藏或隔热容器中 v食用冰块:食用冰块取500g v(2)检样处理 v冷食菜:25g+225ml无菌水中 v瓶装饮料:点燃酒精棉球烧瓶口石碳酸纱 布盖好无菌开盖 v 样品的微生物检测方法 v一、感官检验 v1、色泽 v微生物菌体本身的颜色。 v微生物分泌的色素。 v微生物的代谢产物促使食品发生化学变化。 v2、气味 v 不正常的气味产生,如霉味臭、乙酸臭、胺 臭、粪便臭、硫化氢臭、酯臭等 。 v3、口味 v从口味的改变上反
7、映出来如 酸味、苦味及其它异 味。 v4、组织状态 v固体食品:变形、软化、发粘、结块、湿润。例如 鱼肉因微生物作用使组织细胞破坏,细胞内容物外 溢而呈现肌肉松驰、弹性差,有时表面发粘。 v液体食品:浑浊、沉淀、浮膜、变稠、产气。 v二、样品的微生物镜检 v 直接对样品进行镜检。 v三、培养检验 v(一)培养基的选择 v 细菌 肉汤蛋白胨培养基 v酵母 用酵母菌培养基 v霉菌 用霉菌培养基并加入细菌抑制 剂(孟加拉红70mg/100ml或链霉素 4000g/100ml) v放线菌 用高氏一号培养基 v(二)培养检验方法 v1、种植培养 (1)方法:适用于粒状或块状试样的全菌 和内部菌分析 v直
8、接种植培养 适于全菌分析。样品不做任何处理,直接 点植于平板培养基上。 v表面消毒种植培养 v适于样品的内部菌分析。 v(2)注意事项 v用无菌镊子夹取样品均匀种植在培养皿上 ,微压。 v种植数 9-11cm培养皿 5点或10点 v块将样品切成1cm20.1-0.5cm,每皿3-5 块 v贴标签,注明样品名称、日期、分析方法 、培养 细菌 32 12天;霉菌28 57天 v结果分析 计算菌的检出率; v某菌检出率=检出某菌的点数/种植培养总点 数 v记录培养特征; v镜检形态特征 v2、稀释培养 v 适用于菌量分析:外部菌、内部菌及全 菌 v(1)方法 v洗涤稀释 适于粒状或块状样品外部菌分
9、析 v混合稀释 适于粉状或流体试样的全菌分 析 v捣碎稀释 用组织捣碎器或研钵将定量无 菌水捣碎,试样经表面消毒后也可作内部菌 分析。 v(2)菌落计数 v菌落计数时限 v细菌 定温培养12天 v酵母 23天 v霉菌 57天 v稀释度选择 试用三个连续稀释度,每稀 释度做24套平行平板。 v一般试样:细菌检测用10-2、10-3、10-4 v 真菌检测用10-1、10-2、10-3 v 计数平板选择 v选用同一稀释度各皿的平均菌落数,细菌30 300间,真菌10100间。 v报告 v含菌量(单位重量或体积)=平均菌落数 稀释倍数取样量(采用二位有效数字) v样品的微生物学检验项目 v 一、细菌
10、学检验 v(一)细菌总数的检测 v细菌总数:指单位样品(重量、体积、面积)中所含 的细菌总数(杂菌数) v1、细菌总数的意义 v常作判定样品被微生物污染程度的指标。 v预测样品耐存放的程度和期限。 v细菌越多,菌相越复杂,污染致病菌的机会越多。 v2、细菌总数的检测方法 v检样称取(25克+225ml+玻珠)稀释(十倍稀释) 平皿滴加(选用三个连续的稀释度)培养基的平皿 倾注(45-5010-15ml)培养(37倒置24-48小时 )菌落计数报告 v(二)大肠菌群及其卫生学意义 v大肠菌群指一群37下24小时内能发酵乳糖 产酸产气、好氧或兼性好氧的G(-)无芽孢短杆菌 。 v卫生学意义 作为理
11、想的粪便污染指示菌,它具 备 vA肠道内特有,显示指示特性 vB肠道内数量大,易检出 vC肠外环境中抵抗力强 vD少量存在也能检出 v2、检验方法 v根据证实为大肠菌群阳性的管数,查表报告大肠菌 群的近似数MPN(100ml或100克样品中Most probable Number) vEMB平板上大肠菌群菌落特征:深紫黑色、黑紫色 、淡紫红色。 v v(三)致病性细菌的检测 v 主要指一些能引起人类食物中毒的细菌,主要 有:沙门氏菌、大肠菌、肉毒梭菌、葡萄球菌。食 品卫生法中规定,这四种致病菌不得有检出。 v目前,对样品中病原菌进行检验还存在一定的局限 性。因借一种或少数几种检验方法无法将多种
12、病原 菌全部检出,而采用较多的检验方法在实际工作中 又不现实。同时样品种类多,所处的环境条件不一 ,污染致病菌的种类和数量也不一样。但多数情况 下,污染的病原菌数量不会太多(对环境的抵抗力 弱),一般检验难以检出,故进行致病菌检验时只 能根据食品的特点选一些致病菌作重点检测对象。 v如:蛋粉、肉制品、冻肉禽类常确定沙门氏菌 v 牛奶、罐藏食品常选肉毒杆菌。 v二、真菌学检验 v(一)霉菌的测定 v1、稀释培养法 v 测全菌 固样捣碎稀释 v 粉样、流体样混合稀释 v2、显微镜直接镜检法 v血球计数器计数法 v视野计数法 v 吸管、载片、盖玻等彻底消毒,用吸管准确测 出1ml菌液的滴数,并滴一滴
13、于载玻片上,盖盖玻片 (菌液不外溢或发生气泡),在显微镜下按下列顺 序检视10个视野,记录每个视野菌数,求出平均数 ,再用测微尺测定视野直径,求出视野面积,同时 算出盖玻片面积,则: v每克样品带菌量=C/R.M.L.D/W v(二)酵母菌总数的测定 v1、稀释法 混合稀释、捣碎稀释 v2、镜检法 血球计数板计数法、视野计数 法 v思考题: v1、进行微生物检验时,对样品的采集有何 要求? v2、感官检验样品的卫生质量时,从哪几个 方面入手? v3、怎样进行粒状样品内部菌的检测? v4、什么是大肠菌群?为什么以大肠菌群作 粪便污染的指示菌?如何检测? v5、为什么进行致病性细菌检测时,样品需 要增菌培养?病原性大肠杆菌、肉毒梭菌、 金黄色葡萄球菌三种致病菌的分离平板各是 什么?形成的菌落有何特征?