第九章植物脱毒技术宜职院089

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1、第九章 植物脱毒技术 宜职院08.9 目的与要求目的与要求 了解脱毒意义，学习植物茎尖脱毒原理及其了解脱毒意义，学习植物茎尖脱毒原理及其 操作程序，了解其他组织脱毒方法及应用，掌操作程序，了解其他组织脱毒方法及应用，掌 握植物理化脱毒方法。学习植物脱毒苗的鉴定握植物理化脱毒方法。学习植物脱毒苗的鉴定 方法，掌握各方法的鉴定原理，了解植物脱毒方法，掌握各方法的鉴定原理，了解植物脱毒 苗的保存和繁殖方法。苗的保存和繁殖方法。 具备植物茎尖脱毒技术基础，具有指示植物具备植物茎尖脱毒技术基础，具有指示植物 鉴定脱毒苗的基本能力，有脱毒苗保存的认知鉴定脱毒苗的基本能力，有脱毒苗保存的认知 。 全世界已发

2、现植物病毒有近全世界已发现植物病毒有近788788种。种。 病毒的危害：病毒的危害： 组织和细胞病变组织和细胞病变 新陈代谢等生理机能受到干扰新陈代谢等生理机能受到干扰 外观表现不正常状态外观表现不正常状态 由于危害可通过营养体传给后代，病毒对寄由于危害可通过营养体传给后代，病毒对寄 主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产，主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产， 甚至全株死亡。世界作物生产中，病毒危害程甚至全株死亡。世界作物生产中，病毒危害程 度仅次于真菌。度仅次于真菌。 危害一些植物的病毒数目 植物种 类 感染病 毒种类 植物种 类 感染病 毒种类 植物种 类 感染病 毒种类 菊花19矮牵

3、牛5苹果36 康乃馨11百合6柑橘23 水仙4马铃薯17葡萄26 唐菖蒲5大蒜24草莓24 风信子3豌豆15桃23 月季10樱桃44梨11 所谓所谓脱毒脱毒就是采用一定的方法除去植物就是采用一定的方法除去植物 体内病毒的技术。体内病毒的技术。 无病毒苗无病毒苗：指不含该种植物的主要危害：指不含该种植物的主要危害 病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存 在表现阴性反应的苗木。在表现阴性反应的苗木。 应用植物脱毒技术意义应用植物脱毒技术意义 植物脱毒技术可使植物恢复原来优良特性植物脱毒技术可使植物恢复原来优良特性 ，生长势增强，明显提高产量、改善品质，生长势增强，

4、明显提高产量、改善品质， 产量的提高幅度最高可达产量的提高幅度最高可达300%300%。 植物脱毒技术不仅脱除了病毒，还可以去植物脱毒技术不仅脱除了病毒，还可以去 除多种真菌、细菌及线虫病害，使种性得以除多种真菌、细菌及线虫病害，使种性得以 恢复，植株生长健壮，减少肥料和农药施用恢复，植株生长健壮，减少肥料和农药施用 量，降低生产成本，保护了环境量，降低生产成本，保护了环境 第一节第一节 脱毒方法脱毒方法 一、茎尖培养脱毒 （一）通过茎尖培养脱毒的原理 1、病毒在植物体内的分布 病毒浓度不同，离尖端越远病毒浓度越高。茎 尖或根尖，离体培养便可获得无病毒再生植株。 2、茎尖大小与脱毒 茎尖外植体

5、的大小与脱毒效果成反比。茎尖分 生组织不能合成自身需要的生长素，但下部叶原基 能提供，因而带叶原基的茎尖生长快，成苗率高。 但茎尖越大，脱毒效果差。 （二）茎尖脱毒方法 1、取样与消毒 可直接选定的植株上取顶芽进行消毒接种。采 顶芽与侧芽消毒接种 。 消毒方法是：剪取顶芽梢段3、5厘米，剥去大 叶片，用自来水冲洗干净，在75%酒精中浸泡30秒 左右，用1%-3次氯酸钠或5%-7%的漂白粉溶液消 毒10-20分，最后用无菌水冲洗材料4-5次。 酒精擦拭手 外植体消毒 浸泡5min 器械消毒酒精灯灼烧酒精擦拭培养皿 2 2、茎尖剥离和接种、茎尖剥离和接种 将已消毒的芽放在带滤纸的培养皿上将已消毒的

6、芽放在带滤纸的培养皿上器械固器械固 定定解剖镜下剥去幼叶解剖镜下剥去幼叶切下带切下带1-21-2个叶原基的生个叶原基的生 长点（长点（0.3-0.5mm0.3-0.5mm）切下的茎尖转至培养基上切下的茎尖转至培养基上 （顶部向上）。（顶部向上）。 酒精擦拭旋转灼烧 显微镜下 获取茎尖 接种盖好瓶塞 脱毒马铃薯试管苗 3培养 25+2 ，1500-5000LX，10-16h 一般光照培养比暗培养效果好。其间应更换新 鲜培养基。提高培养基中BA的浓度可形成大量从 生芽。 4生根诱导 诱导生根的方法是将2-3cm高的无根苗转入生 根培养基继续培养1-2个月可生根。 （三）培养基与培养方式 1、培养基

7、：MS， White , Morel等 2、培养方式：一般采用半固体培养基。 （四）影响茎尖脱毒效果的因素（茎尖脱毒技术 的关键） 植物种类、病毒种类、剥离茎尖的大小（0.3- 0.5mm带1-3个叶原基）、培养基营养 用于脱毒的适宜茎尖大小 植物病毒名称 剥离茎尖大 小 （mm） 植物病毒名称 剥离茎尖大 小 （mm） 马铃薯马铃薯卷叶病毒 马 1.03.0百合花叶病0.21.0 铃薯Y病毒1.03.0鸢尾花叶病0.20.5 马铃薯X病毒0.20.5菊花各种病毒0.21.0 马铃薯G病毒0.20.3康乃馨各种病毒0.20.8 马铃薯S病毒0.2以下大丽花花叶病0.6 甘薯 斑纹花叶病毒1.0

8、2.0大蒜花叶病毒0.31.0 缩叶花叶病毒1.02.0甘蔗花叶病0.73.0 羽毛状花叶病毒0.31.0草莓各种病毒0.21.0 二、热处理脱毒 脱毒原理 即热处理脱毒，一些病毒对热不稳定，在高于常温 的温度下（35-40度）即钝化失活。 1、温汤浸渍处理脱毒法 材料置于50左右热水中 浸渍几十分钟到数小时。 特点：简单易行，成本低，但易使材料受伤。适用 ：甘蔗、木本植物和休眠器官的处理。 2、热空气处理脱毒法 将植物用3540的热空 气处理24周或更长时间。 特点：损伤较小，操作简便，须严格控制温度时间 适用：多数植物 3 3、热处理结合茎尖培养脱毒、热处理结合茎尖培养脱毒 目前常采用将热

9、处理和茎尖分生组织培养结合起目前常采用将热处理和茎尖分生组织培养结合起 来的方法脱毒。来的方法脱毒。 特点：既可缩短热处理时间，提高植株成活率，又特点：既可缩短热处理时间，提高植株成活率，又 可剥离较大的茎尖，提高茎尖培养的成活率和脱毒可剥离较大的茎尖，提高茎尖培养的成活率和脱毒 率。率。 适用：大多数植物，并可除去一般培养难以去除的适用：大多数植物，并可除去一般培养难以去除的 纺锤块茎类病毒纺锤块茎类病毒 三、其他组织培养脱毒方法 （一）愈伤组织培养脱毒 将感染病毒的组织离体培养获得愈伤组织， 再诱导愈伤组织分化成苗，从而获得无病害毒植 株的方法，即愈伤组织培养脱毒法。 部分愈伤组织细胞不带

10、病毒可能有以下两方 面的原因： 一是愈伤组织细胞分裂增殖速度快，而病毒复制 速度较慢，赶不上细胞的繁殖； 二是愈伤组织发生了抗病毒突变。 （二）珠心胚培养脱毒 柑橘类种子为多胚种子，除具有合子胚外还有珠 心胚，种子一般不带病毒，因此珠心胚植株不易带 病毒。 （三）微尖嫁接脱毒 指在人工培养基上培养实生砧木，嫁接无病毒茎 尖（0.14-1.0mm,带3-4个叶原基），以培养脱毒苗 的技术。 脱毒程序：无菌砧木培养茎尖准备嫁接 嫁接苗培养移植。 第二节 脱毒苗鉴定 一、直接检查法 直接观察待侧植株生长状态是否异常，茎叶上有 无特定病毒引起的可见症状，从而可判断病毒是否 存在。 二、指示植物法 将一

11、些对病毒反映敏感，症状特征显著的植物 作为指示植物，用以检验待测植物体内特定病毒的 存在。即指示植物法。 特点：条件简单，操作方便，经济而有效，只 能测出病毒的相对感染力。 一些常见病毒病引起的可见病症 症状病毒病名称症状病毒名称 褪绿、黄 化 小麦黄矮病斑点十字花科黑斑病 花叶、斑 驳 烟草花叶病、菜豆花叶病、 黄瓜花叶病 猝倒 、立 枯 棉花立枯病、瓜苗猝 倒病、水稻烂秧病 溃疡 杨树溃疡病、柑桔溃疡病， 番茄溃疡病 萎蔫 棉花枯萎病、茄科植 物青枯病 枯死 马铃薯晚疫病、水稻白叶枯 病 矮化 玉米矮化病、泡桐丛 枝病、小麦丛矮病 穿孔桃细菌性穿孔病徒长水稻恶苗病 疮痂 柑桔疮痂病、梨黑星

12、病、马 铃薯疮痂病 卷叶马铃薯卷叶病 指示植物法指示植物法 几种马铃薯病毒的指示植物及表现症状 病毒种类指示植物表现症状 马铃薯X病 毒（PVX） 千红日、曼陀罗、辣 椒、心叶烟 脉间花叶 马铃薯S病 毒（PVS） 苋色藜、千日红、曼 陀罗、昆诺阿藜 叶脉深陷，粗缩 马铃薯Y病 毒（PVY） 野生马铃薯、洋酸菜 、曼陀罗 随品种而异，有些轻微 花叶或粗缩，敏感品种 反应为坏死 马铃薯卷 叶病毒（ PLRV） 洋酸菜 叶尖呈浅黄色，有些品 种呈紫色或红色 （一）草本植物鉴定 1、汁叶涂抹法 被鉴定植物取13克幼叶加10 毫升水及少量磷酸缓冲液-研碎过滤-加金钢砂作麾 擦剂-汁液在叶面上涂抹23次

13、接种 2、小叶嫁接法 指示植物作砧木，被鉴定植物小 叶作接穗，常用劈接法。 （二）木本指示植物鉴定 1、直接在指示植物上嫁接待检植株的芽片 2、双重芽嫁接 3、双芽嫁接法 部分病毒的木本指示植物及相应症状 病毒种类木本指示植物表现症状 苹果褪绿叶斑病 毒 苏俄苹果 叶片出现褪绿斑点，叶小，植株矮 化，长势弱 苹果茎痘病毒司派227或光辉叶片反卷，植株矮化，皮层坏死 苹果茎沟病毒弗吉尼亚小苹果 植株矮小，接合部内有深褐色坏死 环纹，木质部产生深褐色纵向条沟 苹果花叶病毒兰蓬王、红玉和 金冠 叶片上产生黄斑、沿叶脉条斑 苹果锈果类病毒国光叶和茎干锈斑、坏死斑 葡萄扇叶病毒 葡萄茎痘病毒 沙地葡萄圣

14、乔治 叶片出现褪绿斑点、线纹斑及环斑 、局部坏死、畸形；叶脉间出现星 状透明斑 葡萄卷叶病毒欧亚种葡萄叶片下卷、叶脉间变红 葡萄茎沟病毒Kober 5BB仅在Kober5BB上会产生茎沟 葡萄栓皮病毒LN33节间肿大，部分叶片背面出现栓皮 葡萄金黄病毒Baco 22A植株矮化，叶片下卷、黄化 葡萄脉坏死病110R 叶片背面沿叶脉出现坏死斑，卷须 和嫩梢坏死 葡萄脉斑驳病河岸葡萄褪绿斑，沿脉斑驳，叶片畸形 柑橘碎叶病 腊斯克枳橙、特洛 亚枳橙、卡里佐枳 橙和厚皮来檬 新叶上出现叶片扭曲，叶缘残缺呈 破碎状 三、抗血清鉴定法 特异性高，测定速度快，几小时甚至几分钟就可 以完成。植物病毒鉴定中最有用

15、方法之一。 （一）原理 刺激抗体产生蛋白质抗原。抗原与抗体间能 发生高度专一性的血清学反应（免疫反应） （二）方法 1、叶绿体凝集法 2、块茎沉淀法 3、环形接口法 4、酶联免疫法：用梅标记抗原或抗体的微量测 定法。现在灵敏度较高和常使用的方法。 四、分子生物学鉴定 1、双链RNA法 通过提取纯纯化待测植物RNA，并对其进行电 泳分析，可确定dsRNA存在，从而判断待检植物是 否带病毒。 2、互补DNA（c DNA）检测法 也叫DNA分子杂交法 五、电镜检测法五、电镜检测法 运用电子显微镜可直接检测待检植物体内有无运用电子显微镜可直接检测待检植物体内有无 病毒粒体存在，并根据所观察病毒的形态等对病毒病毒粒体存在，并根据所观察病毒的形态等对病毒 种类进行鉴定。是较为先进的方法，但需一定的设种类进行鉴定。是较为先进的方法，但需一定的设 备和技术。备和技术。 第三节 无病毒苗的保存和繁殖 通过不同脱毒方法所获得的脱毒植株，经鉴 定确系无特顶病毒者，既是无病毒原种。 无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有 可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病 毒苗，就应很好保存，这些原原种或原种材料保 管得好可以保存利用51