中药生物工程与技术课程复 习 生物技术的定义 （1）是应用自然科学及工程学的原理， 依靠微生物、动物、植物体作为反应器， 将物料进行加工以提供产品来为社会服务 的技术 （2）即生物工程，是指以现代生命科学 为基础，结合先进的工程技术手段和其他 学科的科学原理，按照预先的设计，改造 生物体或加工生物原料，为人类生产出所 需的产品或达到某种目的 中药生物技术的含义 • 是以现代生命科学为基础，结合先进的工程技 术手段和其他学科的科学原理，针对中药和天 然药物及其活性成分研究、开发和生产中存在 的具体问题，按照预先的设计，进行生物体改 造或生物原料加工，使其符合中药现代化和产 业化的一门科学技术 • 利用生物技术的基本研究思路和方法研究中药 和天然药物及其活性成分 中药生物技术的主要内容 • 基因工程 • 发酵工程 • 细胞工程 • 蛋白质工程与酶工程 • 抗体工程和组织工程 • 一、生物技术在高质量中药原料的研究和生 产以及中药材资源的可持续利用中有巨大的 应用潜力 1.中药基因研究是中药资源保护、种植和 可持续利用的重要手段 建立珍稀濒危中药材的基因库；高抗性的转基因药 用植物；选育优良品种；道地性药材遗传特征分析 中药生物技术发展概况 抗除草剂大豆 样品比较（左为普通棉花， 右为兔毛转基因棉花） 2.细胞工程技术为中药和天然药物人工资源 的开发提供了有效途径 药物植物的快速繁殖、脱病毒 大规模培养技术 克隆技术，虎、穿山甲等 3.发酵工程技术为现代中药的生产提供了重 要手段 冬虫夏草菌发酵生产的菌丝体及产物 紫杉醇：生物合成和生物转化技术 4.蛋白质工程和酶工程为中药和天然药物活性 成分生产提供了最佳技术手段之一 人参皂苷的转化 二、生物技术为提高中药和天然药物品质评 价水平提供了新的实验方法 基因鉴别技术为中药材品种鉴定提供了新手段 三、生物技术为中药和天然药物新药研究与 开发提供了新的工具和途径 1.生物芯片 2.生物转化和生物组合化学 第一篇 基因工程技术 与中药研究 分子生物学基础知识 • 分子生物学是对生物 大分子进行结构和功 能研究的一门科学。
• 主要是核酸生物学 •核酸的种类 •DNA 脱氧核糖核酸 •RNA 核糖核酸 •组成核酸链的单体 •DNA和RNA链的形成 •DNA和RNA链的区别 DNA的结构 • 一级结构 • 二级结构 • 三级结构 核苷酸的排列顺序 一 5’5’ 3’3’方向的判断方向的判断 B－DNA、A－DNA、Z－DNA等 •DNA双螺旋结构 •DNA超螺旋结构 DNA的功能 DNA携带两类不同的遗传信息： 一类是负责蛋白质氨基酸组成的信息； 二类是相关基因选择性表达的信息 RNA的功能 • rRNA 是构成核糖体的骨架 • tRNA 转动氨基酸 • mRNA 蛋白质合成的模板 种类非常多，每一种的含量非常低 3’端有poly(A)尾巴，5’端有m7G帽子 • DNA的生物学特性 变性 复性 DNA分子的变性 原核生物基因原核生物基因 原核生物基因特征原核生物基因特征 1.操纵子结构; 2.蛋白质基因单拷贝; 3.RNA基因多拷贝; 4.结构基因是连续的,没内含子; 5.大部分DNA用于编码蛋白质; 6.重复序列少. 植物细胞中DNA的提取 一般步骤： （一）材料的预处理 （二）提取 （三）杂质的去除 提取 1.CTAB法原理 可破坏细胞膜使DNA释放到缓冲液中； 可保护DNA免受内源性核酸酶的降解； 可与核酸形成复合物，在高盐溶液中可 溶并且很稳定，降低盐的浓度可使之沉淀 出来； 用乙醇可将复合物分离开来，核酸沉淀 下来，CTAB溶于乙醇中。
• CTAB法提取步骤 加入10%CTAB提取液进行提取 离心分离复合物沉淀 溶于高盐溶液中 乙醇沉淀DNA • 基因工程：指在体外将核酸分子插入病 毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物 质的新组合，并使之参入到原先没有这 类分子的宿主细胞内，能持续稳定地繁 殖和表达外源DNA 基因工程的主要内容和步骤 • 获得目的基因；（切） • 构建重组DNA分子；（接） • 转化重组DNA分子；（转） • 扩增重组DNA分子；（增） • 筛选阳性重组克隆；（筛） • 提取扩增的目的基因； • 构建重组表达载体，转入宿 主细胞，实现目的多肽或蛋 白的表达 分子克隆分子克隆 基因工程常用工具酶 • 限制性内切酶（切）； • DNA连接酶（接）； • DNA聚合酶 限制性内切酶 • 是一类能识别和切割双链DNA分子中特定 碱基序列的核酸水解酶 • 通过切割DNA分子，对含有特定基因的片 段进行分离、分析 • 常用的限制性内切酶为Ⅱ型限制性内切酶 DNA连接酶 • 用于将两段乃至数段DNA拼接起来的酶称 为DNA连接酶 • 它能催化5’磷酸基与3’羟基之间形成磷 酸二酯键。
• T4DNA连接酶：来自T4噬菌体，作用底物 必须是双链DNA，既可连接匹配的粘性末 端，也可连接平末端，最常用 DNA聚合酶 • 以DNA或RNA为模板，催化dNTP连续加到双 链DNA引物链3’-OH末端，合成与模板互 补的DNA • Taq DNA聚合酶：DNA测序和PCR反应 • 大肠杆菌DNA聚合酶（全酶）Ⅰ及其大片 段（Klenow片段） 基因克隆载体 • 基因克隆载体：指在特定系统中能自我复制的 DNA分子 • 所分离的外源DNA一般并不带有复制控制系统及 在新的受体细胞中实现功能表达所需的调控系 统 • 克隆载体：以繁殖DNA片断为目的的载体 • 表达载体：用来将克隆的外源基因在寄主细胞 内表达成蛋白质的载体 克隆载体 • 必备条件： 复制原点； 合适的限制性内切酶酶切位点； 筛选标记； 拷贝数多； 易与寄主DNA分开 克隆载体 • 质粒载体： 以细菌质粒（细菌细胞内一类独立于染色体而 能自我复制的环状双螺旋小分子DNA）的各种元 件为基础组建而成的基因工程载体 质粒载体pBR322图谱 • 表达载体的必须元件： 复制原点； 合适的酶切位点； 强的且能被寄主的RNA聚合酶识别的启动子； 强的转录终止序列； 所产生的mRNA要有AUG和S-D序列。
基因表达载体 表达载体 • 分胞内表达和分泌表达载体 • 原核细胞表达载体和真核细胞表达载体 • 融合型表达载体和非融合型表达载体 目的基因的获得 • PCR方法 • 自基因组文库中分离 • 化学合成法 • 限制酶法（鸟枪法） • 物理分离法 PCR方法 • Polymerase Chain Reaction • 基本原理： 变性、 退火、 延伸 目的基因与载体的体外连接 • 粘末端DNA片断的连接 • 平末端DNA片断的连接 • 粘平末端DNA片段连接 重组基因转入受体细胞 • 将重组质粒DNA转入受体细胞称为转化 • 将重组分子引入宿主细胞的方式有：转化、转 导、转染、杂交、细胞融合、脂质体介导转移 、显微注射法、电穿孔法等 重组体的克隆与筛选 • 克隆：无性繁殖 • 筛选方法： 直接筛选和间接筛选 1.遗传学直接筛选：利用可选择的遗传表型和功能进 行筛选，如抗药性、营养缺陷型 2.间接法：根据分子生物学特性 遗传学直接筛选可靠性较差，可作为初筛；分子生物 学的间接法可靠性强，可作为最后鉴定 外源基因的高效表达和调控 • 外源基因表达是指利用被克隆入某一种载体的 目的基因产生蛋白质的过程。
• 表达过程包括转录、翻译、后加工等 • 每个步骤都是在各调节因子控制下完成的 • 原核基因在原核细胞中表达较易； 真核基因可在真核细胞或原核细胞中表达 DNA分子标记 • 20世纪80年代以来发展起来的； • 由于同种生物具有相同的DNA序列，不同 种生物具有不同的DNA序列，可以依据 DNA序列的差异来鉴定生物物种 遗传多样性与DNA多态性 • DNA多态性是指染色体等位基因中核苷酸 排列顺序的差异 • 等位基因：染色体同一位点处可决定某一遗传性状 的几个基因； • 生物遗传多样性是DNA多态性的结果 • DNA多态性是基因突变的结果 基因突变：A.有利突变 B.中性突变 C.不利突变 DNA分子标记技术 • 分子标记：指能反映生物个体或种群间基因组中某 种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差 异 广义：可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质； 狭义：DNA分子标记 • 可分为三类： （1）基于分子杂交的分子标记技术； （2）基于PCR的分子标记； （3）DNA序列测定 DNA分子标记 用于生药鉴定的优点 • 特异性强、稳定性好、微量、便捷、准确 等特点； • 适合于近缘品种、易混淆品种、珍稀品种 、动物药材、破碎药材、陈旧药材、腐烂 药材及植物模式标本、中药出土标本、古 化石标本等 RFLP技术 • Restriction fragment length polymorphism • 限制性内切酶切片段长度多态性； • 由于不同物种基因组内限制性酶切位点的 不同造成酶切后DNA片段长度发生变化， 限制性片段的长度在不同个体间呈多态性 现象，即称为限制性片段长度多态性 DNA多态性产生的方式 • 基因点突变，造成原有切点消失或产生新 的切点； • 结构重排： （1）缺失、倒位或插入等引起的DNA顺序的突变； （2）多个串联重复顺序组成的高变区，由于重复顺 序的拷贝数不同造成限制性内切酶识别位点在基因组中 的相对位置发生改变。
RFLP基本步骤 • 靶DNA的制备； • 核酸探针的标记 • 杂交显示 第二篇 发酵技术及其在中药 研究中的应用 一.发酵与发酵工 程 1.发酵 早期：酵母菌作用于果汁或麦芽 汁产生气泡的现象，或者指酒的生产过 程 生化学：微生物在无氧条件下的 分解各种有机物质产生能量的一种方式 现代发酵：利用微生物的生命活 动来制造产品的过程 1. 2.发酵工程 又称微生物工程，发酵技术，是将微 生物学、生物化学和化学工程学的基本 原理有机结合，利用微生物的代谢、转 化功能，获得有用物质的工程技术 发酵工程是“研究利用微生物的工 业，即微生物参与的工艺过程” 三.发酵工程的内容和特点 1.发酵工程的内容 发 酵 工 程 上游工程 发酵工程 下游工程 菌种选育、最适发酵条 件、培养基的筛选 培养基制备和灭菌，发酵罐、管 路的灭菌，无菌空气的供给，种 子培养，生产培养及控制，补料 产品的分离纯化 2.发酵工程的特点 ① 反应条件温和，设备简单； ② 微生物生长繁殖迅速，发酵周期短； ③ 发酵原料来源广泛，价格低廉； ④ 反应以微生物的自动调控方式进行； ⑤ 易产生高分子化合物及对其转化； ⑥ 可对菌种进行改良； ⑦ 可大量生产新的活性物质。
四.微生物发酵类型 1.微生物菌体发酵 目的：获得微生物菌体细胞 酵母和藻类、担子菌， 苏云金芽杆菌、疫苗等 特点：细胞的生长与产物积累成 平行 关系，生长稳定期产量最高 2.微生物酶发酵 目的：获得酶制剂和酶调节剂 青霉素酰化酶、糖苷酶抑制剂 血管紧张素转化酶抑制剂 氨肽酶抑制剂 特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑 制等调控作用的影响，在菌种选育、培养 基配制以及发酵条件等方面需给予注意 3.微生物代谢产物发酵 。