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1、病毒学的研究方法 分离技术 电子显微镜技术 组织和细胞培养技术 血清学方法 分子生物学方法 图1.1 混合物分离 原料（混合物） 残余物 分离设备 分离剂 产 品 进一步综合利用 一、分离技术 机械分离 传质分离 分类 反应分离 1、机械分离 过滤分离：过滤介质 固体颗粒大小 沉降分离：重力作用 密度差 离心分离：离心力 密度差 旋风分离：惯性力 密度差 静电除尘：静电场 使细颗粒带电 特点：相间无物质传递 离心 常用于病毒的纯化 A:等速度沉降，B:等密度沉降 2、传质分离 平衡分离过程： 蒸发、蒸馏、吸收、萃取、结晶、离子交换、吸附 、干燥、浸取、泡沫吸附等 传质分离 速率控制分离过程：
2、气体扩散 热扩散 电渗析 电泳 反渗透 微滤、超滤和纳滤 3、反应分离 可逆反应（如离子交换、反应萃取）；不 可逆反应（反应吸收、反应结晶）；分解 反应（生物分解、电化学反应、光化学反 应）等。 二、电子显微镜技术 1932年Ruska发明了以 电子束为光源的透射电 子显微镜（TEM），电 子束的波长要比可见光 和紫外光短得多，并且 电子束的波长与发射电 子束的电压平方根成反 比，也就是说电压越高 波长越短。目前TEM的 分辨力可达0.2nm。 技术方法 负染色法 超薄切片技术 免疫电镜技术 冷冻电镜技术 肌动蛋白纤维的负染电镜照片 用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载 网上的样品进行
3、染色。 1、负染色法 通常以锇酸和戊二 醛固定样品，以环 氧树脂包埋，以热 膨胀或螺旋推进的 方式推进样品切片 ，切片厚度 2050nm，切片采 用重金属盐染色， 以增大反差. 莱卡超薄切片机 2、超薄切片技术 冰冻蚀刻,亦称冰冻断裂。标 本置于-100C的干冰或-196C 的液氮中，进行冰冻。然后用 冷刀骤然将标本断开，升温后 ，冰在真空条件下迅即升华， 暴露出断面结构，称为蚀刻。 在电镜下得到的影像即代表标 本中细胞断裂面处的结构. 3、冰冻蚀刻 人冠状病毒（左） 与SARS冠状病毒 病毒粒子三维重构模型 电镜观察发现痘病毒 是整个病毒粒子通过 吞噬作用进入细胞的 三、组织和细胞培养技术
4、指从机体中取出组织或细胞，模拟 机体内的生理条件在体外进行培养 ，使之生存和生长。 1、组织组织 培养的原理 组织组织 培养主要是为为病毒易感的组织细组织细 胞提供一个良好的生存环环境，使细细胞 对环对环 境产产生适应应性，获获得生长长繁殖的 能力。 群体培养（左）和克隆培养（右） 群体培养: 将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶 中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层 。 克隆培养: 将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶 中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增 殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。 2、细胞培养技术 原代和次代细胞培养：分离病毒最为敏感 二倍体细胞 ：用于病毒分离
5、和疫苗制备 传代细胞系 ：用于病毒的分离鉴定和抗病 毒药物筛选研究。 病毒基因转染细胞系：用于病毒基因调控 和抗病毒药物的研究。 常用的细胞培养 细胞病变效应（CPE） 由病毒增殖引起的细胞改变，称细胞病变 效应。 3、细胞培养的基本条件 细胞接种数：接种传代细胞一般为1030万/ml 合成培养液：如Eagle氏液，RPMI1640， Eagles MEM。 酸碱度：细胞生长最适宜的PH范围是7.07.4。 温度：细胞培养的最适温度与细胞来源的动物体 温一致。 无菌条件 培养器皿的处理 4、组织培养的优缺点 优点：可提供大量生物性状相同的细胞作为 研究对象，对疫苗生产来说，其抗原性更接近 于自
6、然流行株，可减少宿主蛋白成分，减少变 态反应。 缺点：病毒复制后滴度低，不易保存，保存 时易使病毒滴度丢失，传代细胞含致癌因子， 不宜用于疫苗生产。且随着细胞代数增加，对 病毒敏感性也随之下降。 四、血清学方法 中和试验：适用于病毒鉴定，机体中抗体 的检测，分析病毒抗原的性质，疫苗接种 效果评估等 补体结合试验 血凝抑制试验：常用于正粘病毒和副粘病 毒感染的诊断和病毒亚型鉴定及抗原变异 的监测，如流感病毒的分型 酶联免疫吸附试验 放射免疫试验免疫荧光检测 五、病毒学研究常用方法 聚合酶链反应（PCR） 转印杂交 ：Southern blot、Nouthern blot和Westhern blot 蛋白质组学：肽图谱 基因组学：核酸序列测定及基因功能 基因工程 ：抗病毒疫苗或抗病毒的大分子 多肽 、病毒载体
