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1、第三章 动物基因工程基础,限制性内切酶 克隆载体 重组基因的导入和筛选 获得真核生物目的基因的方法,基因工程研究的理论依据,不同基因具有相同的物质基础 基因是可以切割的 基因是可以转移的 多肽与基因之间存在对应关系 遗传密码是通用的 基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代,DNA重组技术要有四个必要条件：,工具酶、 基因、 载体、 受体细胞,DNA限制性内切酶可分为三类： 、 、酶在基因工程中基本不用,why?,第一节限制性内切酶,限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点分子手术刀 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共
2、同获得了1978年的诺贝尔奖。,、限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖于ATP的限制性内切酶活性。 类酶结合于特定的识别位点，但却没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的、特异性切割末端。 类酶在识别位点上切割DNA，然后从底物上解离下来。,核酸内切限制酶的类型及其主要特性,一、II类限制性内切酶的特点,识别特定的核苷酸序列，其长度一般为4、5或6个核苷酸且呈二重对称，但有少数酶识别更长的序列或兼并序列； 具有特定的酶切位点 ，产生出特定的酶切末端5突出粘末端、3突出粘末端、平末端； 类限制修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统；限制性内切酶、独立的甲基化酶。,
3、被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做 粘性末端。,EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段,Sma特异识别CCCGGG,形成平末端,二、使用限制性内切酶时应注意的问题,1、仔细查阅酶的识别序列和切割位点。 同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的限制性内切酶。 同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序列，但切割后DNA分子所产生的粘性末端却相同，这类酶为具不同酶切位点的DNA片段重组提供了方便，但要注意，往往相容的粘性末端再用DNA连接酶连接后，都不能再被其切割了。,2、注意酶反应条件，相同反应条件的酶可
4、以同时酶解DNA样品。 3、注意说明书中所列出的comments的内容，会提供有关限制性内切酶识别序列中位点特异性甲基化的信息以及引起酶产生star activity的原因。,star activity：指当酶的反应条件改变时，其在识别序列中的酶切位点发生改变。 产生的原因：反应体系中甘油的浓度12；酶：DNA比率25u/g ；缺少Nacl和存在Mn2。,4、注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。 一般以在20l反应体积中，37，每小时水解1微克DNA的酶量定为一个酶单位。 5、注意酶在保温过程中的活性变化。 ACC在5 小时内具有全部活力 BamH在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具有
5、部分活力，而在2小时以后就无活力了。 Cfo仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后就没有活力了。,三、连接酶 定义：用于将两端乃至数段DNA片段拼接起来的酶。 用途： （1）、连接带匹配粘末端的DNA分子； （2）、使平末端的双链DNA分子相互连接或与合成的寡核苷酸接头相连接。 这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离子（150-200mmol/LNacl）或低浓度的聚乙二醇（PEG）可提高连接效率。,DNA连接酶,连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。,四、修饰酶,1、DNA聚合酶： 大肠杆菌DNA聚合酶I：3种催化活性 klenow 大片段酶：2种催化活性
6、T4噬菌体DNA聚合酶： 2种催化活性 T7噬菌体DNA聚合酶： 2种催化活性 耐高温DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶） 反转录酶： 3种催化活性 末端脱氧核苷酸转移酶等,2、依赖于DNA的RNA聚合酶： SP6噬菌体及T7和T3噬菌体RNA聚合酶 用途 :在in vitro条件，合成单链RNA作为杂交探针,3、T4噬菌体多核苷酸激酶： 催化ATP的磷酸基转移至DNA或RNA片段的5末端。 用途：标记DNA片段的5端 ，制备杂交探针；基因化学合成中，寡核苷酸片段5磷酸化；用于测序引物的5标记。,532 P,OH 3,HO,32P,3,5,32P ATP,4、碱性磷酸酶： 用途： 去除DNA片
7、段5末端的磷酸，以防止在重组中自身环化，从而提高重组效率； 在用32pATP标记DNA或RNA的5末端前，去除DNA或RNA片段的非标记的5磷酸。,5 P,OH 3,HO,P,3,5,5突出末端,5隐蔽末端,OH,HO,5HO,OH 3,3,5,第二节克隆载体,基因工程载体应具备的条件： 能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制； 具有合适的限制性内切酶位点： 在载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不同限制性内切酶切割后的外源DNA片段方便的插入载体； 在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增； 载体的分子量要小，这样可以容纳较大的外源DNA插入片段： 在细胞内稳定性高，这样可
8、以保证重组体稳定传代而不易丢失； 应该有一个或多个选择标记。,大肠杆菌表达载体应具备： 强的启动子，一个强的可诱导的启动子可使外源基因有效的转录； 在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD）； 在外源基因插入序列的下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因的有效转录和质粒的稳定性。,一、质粒(plasmid),定义：质粒是能自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。,A,OC,SC,L,质粒载体的基本要求,具有复制起点 应包含一个可供选择的标记基因 具有多克隆位点 具有较小的分子量和较高的拷贝数,F质粒：有些携带有帮助其自身从
9、一个细胞转入另一个细胞的信息的质粒。 R质粒：表达对一种抗生素的抗性的质粒。 降解质粒：携带参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因的质粒。 穿梭载体：在大肠杆菌的载体上放上第二个复制起始位点，使它在另一个宿主细胞中也能进行复制。,1、质粒载体pBR322 特点 1）大小为4363bp； 2）含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）； 3）有单一的BamH、Hind和Sal的识别位点（在四环素抗性基因内）、Pst识别位点（在氨苄青霉素抗性基因内）； 外源片段在BamH、 Hind、 Pst位点插入时，可引起抗生素失活来筛选重组体。 4）带有一个复制起始点，可以保证这个质粒只在大肠杆菌里行使复
10、制功能，在大肠杆菌里pBR322以高拷贝数存在。,2、质粒载体pUC19 1）特征 大小为2686bp；乳糖操纵子半乳糖苷酶 带有pBR322的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因； 一个大肠杆菌乳糖操纵子半乳糖苷酶基因的调节片段（lacZ）,一个调节lacZ基因表达的阻遏蛋白的基因lacI； 含有多个单克隆位点。,2）pUC19的筛选： 培养基中含有异丙基硫代半乳糖苷（IPTG，lac操纵子的一个诱导物）时，lacI的产物就不能与lacZ的启动子区域结合，质粒pUC19的lacZ就可以转录，进而翻译，lacZ蛋白会与染色体DNA编码的一个蛋白形成具有活性的杂合半乳糖苷酶； 在底物5溴4氯3吲
11、哚半乳糖苷酶（X-gal）存在下，X-gal会被杂合半乳糖苷酶水解成蓝色的产物，没有插入外源DNA序列的pUC19质粒克隆就呈蓝色； 由于pUC19的单克隆位点的序列是整合在lacZ之中的，若pUC19质粒中插入有目的DNA片段，就会破环lacZ的结构，导致细胞无法产生功能性的lacZ蛋白，也就无法形成杂合的半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。,互补原理,载体：含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列，并在编码序列中插入了一个MCS 受体菌：为半乳糖苷酶C端序列编码 互补：宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质 lacZ基因在缺
12、少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补,穿梭质粒:人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。,二、噬菌体,噬菌体可以进入裂解循环，20分钟后就可使宿主 细胞发生裂解，同时释放出大约100个噬菌体颗粒。,噬菌体也可以进入溶源循环，即注入的DNA整合到大肠杆菌的染色体中，以前噬菌体的形式潜伏起来，永久保留。,噬菌体DNA大约长50kb，其中大约20kb对于整合切割过程极为关键，称为整合切割（I/E）区域。 对于构建文库，可将这20kbDNA片段去掉，强迫重组的噬菌体进入裂解循环。,噬菌体头的大小足以装下50kb单元的线性
13、DNA， DNA52kb,则无法包装进头部 cos位点（cos site）就是保证在超长线性DNA分子上每两个cos位点之间为50kb,使DNA分子能正确的装配进噬菌体 在头的入口处有一种酶，它能识别双链线性DNA分子上的cos序列，并在cos序列处切断DNA分子，使适当大小的DNA进入噬菌体的头部,噬菌体DNA分子示意图,三、柯斯质粒（cosmid） 可携带40kb大小的DNA片段，并在大肠杆菌中复制保存，综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优势。 柯斯质粒上带有多个单克隆位点、两个cos位点、DNA复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个cos位点之间含有一个限制性内切酶位点（RE）。,应用柯斯质
14、粒载体进行基因克隆的一般程序,利用柯斯质粒克隆大片段DNA,四、YAC载体 1、目前能容纳最大外源DNA片段的载体是YAC（酵母 人工染色体，yeast artificial chromosome）。 2、真核生物染色体三个关键部分： 着丝粒（centromere,CEN）,它主管染色体在细胞分裂过程中正确的分配到各子细胞中； 端粒（telomere,TEL）, 位于染色体的末端，对染色体末端的复制以及防止染色体被核酸外切酶切断具有重要的意义； 自主复制序列（autonomously replicating sequence,ARS）,即在染色体上的多处DNA复制起始位点。,3、作为真核基因表
15、达载体应具备如下条件： 含有原核基因的复制起始序列（如ColE1起始序列ori）筛选标记； 含有真核基因的复制起始序列（如SV40病毒的复制序列、酵母的2质粒的复制起始序列ARS、以及真核细胞筛选标记（如氨基糖苷G148抗性基因、在酵母细胞中与自养有关的基因）； 含有有效地启动子序列（可包含增强子序列等各种顺式作用元件）； RNA聚合酶所需的转录终止和poly(A)加入的信号序列； 合适的供外源基因插入的限制性内切酶位点。,4、YAC 的主要功能成份有三：,1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减数分裂同源染色体分离之必需 2）端粒 3）自主复制序列（ARS）元件 4）构建YAC需要4个短序
16、列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，选择标记，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆,pYAC4结构图,第三节 受体细胞,接受遗传物质的细胞 能摄取外源DNA并使其稳定存在，具有重要的应用价值和理论价值,一、原核生物细胞表达系统,优点 大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA导入 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质 基因组小，遗传背景简单 繁殖迅速，实验周期短，重复实验快,一、原核生物细胞表达系统,问题 真核基因修饰 DNA与细胞分裂的关系 细胞的特异性分化 热源、内毒素不易除去、产品难纯化 包涵体提纯繁琐 蛋白质复性困难，易出现肽链的不正确折叠,二、真核生物细胞表达系统,真核生物由多细胞组成，有明显的细胞分化和细胞核 真核细胞的一条成熟的mRNA只能翻译出一条
