多重PCR技术

《多重PCR技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《多重PCR技术（25页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、多重PCR技术 讲解框架 v第一、多重PCR技术原理 v第二、多重PCR实验设计：大致的如何操作 v1、 多重PCR扩增区域的选择 v2、 引物的设计（关键步骤） v3、多重PCR反应条件的确定 v第三、多重PCR条件优化 v1、反应体系优化 v2、引物设计 v3、模板核酸质量 v4、循环参数优化 v第四、多重PCR技术结果分析 v第五、多重PCR技术在食品中的应用 一、多重PCR技术原理 vPCR是什么：聚合酶链式反应。是一种体外快速扩增特定基 因或DNA片段的分子生物学技术。 v其基本原理是：以一对寡核苷酸为引物，在模板DNA、 dNTP(脱氧核苷三磷酸) 、适当缓冲液Mg2+的混合体系中

2、， 在DNA聚合酶的催化下，根据碱基互补配对原则，对引物所 界定的DNA片段进行扩增。这种扩增通过模板DNA与引物之 间的变性、退火和延伸三个步骤为一循环，每次循环产生的 DNA片段作为下次 循环的模板，所以PCR扩增产物呈指数 增加。多重PCR是在传统PCR原理的基础上进行改进，即在 同一体系中加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模 板的不同区域扩增出多个目的DNA片段。 二、多重PCR实验设计：大致的如何 操作 v所要求的东西主要是：菌株、培养基、供试 药物、试剂 v培养基：分离培养基、增菌培养基 v主要试剂：Taq DNA聚合酶，dNTPs v主要仪器：PCR仪、恒压恒流电泳仪、凝

3、胶 成像仪、常温离心机、浴式振荡器、电热恒 温水浴锅等等 v操作方法：第一、多重PCR扩增区域的选择 v由分析目的来决定：缺失分析选择扩增外显子 v法医学鉴定个体差异选择扩增高度多态性标志 v微生物鉴别分析可能利用种或株DNA特异性变化区 域 v转基因检测则选择转入的动植物基因座 v性别鉴定一般挑选X或Y性染色体上特有的基因座 v第二、引物的设计（关键步骤） v1、引物位置的确定：首先需要知道所选择的基因 引物位点的详细DNA序列信息。 v引物的DNA序列应该有很强的特异性，否则引物会 结合在其他位点上发生非特异性扩增。 v2、引物序列的测定：引物的设计是多重PCR成功 的重要保证：事先通过G

4、DB（基因数据库）、 NCBI（生物技术信息中心）查引物相关位点的DNA 序列信息。 v3、引物序列的比较：引物间连续互补不能超过4bp ，以防止发生交叉错配。 v第三、多重PCR反应条件的确定： v首先进行单个PCR，分别设定各引物对反应 条件。然后，依次增加引物对，不断调整反 应条件直至最后保证所有的引物对都能在同 一条件下扩增出目的条带。 多重PCR技术在植物病毒检测中温度 的确定 三、多PCR条件优化 v多重PCR是在传统PCR基础上改进并发展起 来的，但并不是单一PCR的简单混合，在实 际操作中常常受到反应条件和反应体系等多 种因素的影响。 1、反应体系优化原则 v1、确保所有的靶位

5、点可以用相同的PCR程序 在单个反应中得到有效的扩增； v2、在使用相同的PCR程序和反应条件的单个 PCR中对每对引物的量进行优化，以达到最 大的扩增效率； v3、平衡多重PCR中每对引物的量，使之对每 个靶点都能获得足够的扩增量。 2、引物设计（关键优化） v多重PCR中的每对引物必须满足单引物PCR体系的 引物设计原则。这些原则包括：引物与模板的序列 紧密互补，长度一般为1530bp，GC含量一般为 4060；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体 或发夹结构；引物不能在模板的非目的位点引发 DNA聚合反应(即错配)。由于多重PCR体系中同时 存在多对引物，在引物设计时还应注意：各引物对 必

6、须保持高度的特异性，避免非特异扩增；尽可能 避免所有引物间的相互作用，各引物对应保持相对 一致的扩增效率，且不同引物对扩增出来的产物能 通过电泳或其他方法区分开。 3、模板核酸的量 v模板核酸的量和纯度是PCR成败的关键环节 之一。模板量太少，会出现阴性结果或条带 很弱；模板量太多则会出现条带弥散，模糊 不清；模板纯度低或被降解会导致扩增的不 整齐。模板核酸片段还必须具有高度的特异 性，以避免非特异性扩增，保证检测的准确 性。另外，各片段长度应具有明显差异，以 有利于扩增后产物的区分。 4、循环参数的优化 v在传统PCR反应中，一个体系通常采用一个 退火温度。在多重PCR体系中，不同长度的 模

7、板核酸片段、不同的引物对所要求的退火 温度不一样。黄银花等人通过研究证实，在 15 u L的反应体系中含有多个退火温度的多 重PCR反应条件的扩增效果比采用一个退火 温度的效果好，基本能满足多重PCR的要求 。一般来说，在解链温度Tm值允许范围内， 选择较高的退火温度。 v多重PCR的退火时间比传统PCR稍微延长， 有助于引物与模板的完全结合。延伸时间则 要根据模板核酸的长度决定。黄银花等经过 反复的优化实验发现，多重PCR的延伸时间 比传统PCR循环时延伸时间为40s长，他们 认为循环时延伸时间为1min的扩增效果好， 扩增产物加尾整齐。 5、反应体系优化 v由于多重PCR体系中加入多对引物

8、，因此反应体积和反应体 系中的各成分也应做相应的调整。有学者通过实验认为， 20uL与15uL的反应体积能达到多重PCR扩增要求，并同时 对PCR缓冲液进行了改进，认为多重PCR理想的缓冲液为： 1.5mmolLMgCl，50mmolL KCl，10mmolL HCl pH=8.3，1mmolL TMAC，0.01明胶。同时有研究表明 ，Mg2+浓度与dNTP浓度有相关性，对于一个25uL的反应体 系，当Mg2+浓度为1.5mmolL时，dNTP推荐浓度为200 u molL。多重PCR反应体系中，不同的反应会不同程度的竞 争DNA聚合酶，因此在反应体系中适当多加入一些DNA聚合 酶，可获得更

9、佳的扩增效果。 四、多重PCR的结果分析 v某些多重PCR系统，特别是那些鉴别点突变 或其他微小变化的系统，其PCR产物除琼脂 糖电泳外，还需要进一步的分析。许多已建 立的单个PCR产物分析技术可以直接应用于 多重PCR分析，如限制性内切酶消化、放射 性探针杂交、毛细管电泳和单链构象多态性 （SSCP）分析都可以用来做多重PCR产物 的常规分析。 五、多重PCR技术在食品中的应用 v多重PCR在食品安全检测中的应用 v多重PCR技术在肉品致病菌检测中的应用 v应用多重PCR技术检测肉品中的致病菌主要 是根据该菌的特异性基因设计出合适的引物 ，对基因的高度保守区进行扩增。 v对肉品中单一病原菌的

10、检测 v对于血清型较为复杂的病原细菌，如沙门氏 菌，致病性大肠杆菌等，采用传统PCR检测 单一基因片段，特异性不高，影响检测样品 的有效性。多重PCR技术针对病原菌多个高 度保守的基因序列设计引物进行扩增，提高 特异性，减少假阳性。 多重PCR技术在病原检测中的应用 v应用多重PCR方法对感染性疾病病原检测上 要有两个方法：一是针对每一种病原的单个 特异基因进多重检测，同时检测一种或几种 病原体的存在与否；一是针对某一病原的多 个基因进行多重检测，可以减少假阳性结果 的出现。 v可系统组合的有： v肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者体内 ，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，如：甲、乙、 丙型肝

11、炎病毒重叠，甲、乙型肝炎病毒重叠，已、 丙型肝炎病毒重叠等；肠道敛病性细菌的检测， 如伤寒、痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状 ，有时痢疾、霍乱同一个病人并同时发病；性传 播疫病：梅毒、淋病及艾滋病的检测；战伤细菌 及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌、产气荚膜 杆菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌等的质检。 存在问题和技术展望 v多重PCR在实际应用中一旦有极少量外源性 DNA污染，就可能出现假阳性结果：多对引 物同时扩增，各种试验条件控制不当，很容 易导致扩增失败或非特异性产物；引物的设 计及靶序列的选择不当等都可能降低其灵敏 度和特异性。此外，对食品样品进行检测时 ，增菌培养基选择不当易使有的细菌生长缓 慢或被抑制，导致假阴性的结果。 v今后的技术发展尚需延伸： v(1)DNA模板的提取和纯化方法。 v(2)反应条件的优化。 v(3)增加反应引物对数，真正实现高通量。 v(4)与其他分子生物学技术相结合。