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1、人源化抗体发展及应用概略【摘要】伴随着一系列重大生物技术（如PCR技术、抗体库技术、转基因动物技术等）的发展，抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。人源化抗体在治疗肿瘤、自身免疫性疾病、器官移植等方面已经显示出独特的优势和良好的应用前景。 本文介绍了人源化抗体的构建及其表达系统，并对其临床应用进行了展望。【关键词】 嵌合抗体；人源化抗体；噬菌体展示技术；转基因技术【Abstract】With the development of a series of substantial biotechnologies, such as PCR, phage display and
2、 transgenic animal, antibody techniques have developed from chimeric antibody and reshaped antibody to humanized antibody. As therapeutic antibodies, the humanized antibodies have been showed specific advantage and application prospect for cancer therapy,autoimmudisease,transplant rejection.The huma
3、nized antibody construction and expressing system, also foresaw tendency of humanized antibodies in clinical application have summarized in this paper.【key word】chimeric antibodies; humanized antibodies; phage display; trangenic technology引文：从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来，单克
4、隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而，单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody,HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免
5、疫原性，成为单克隆抗体研究的重点。正文：1.人源化抗体的建构策略鼠抗体人源化就是通过基因改造，使其和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导HAMA反应。对鼠源抗体进行人源化改造时要遵守两个原则，首先要保持抗体的亲和力和特异性，其次要降低或消除抗体的免疫原性。1.1 嵌合抗体(Chimeric antibody)20世纪80年代中期开始研制的第一代人源化抗体，即简单的嵌合抗体，是用人源基因代替鼠源单抗的恒定区。这样构建的嵌合抗体不仅保留了抗原抗体结合的特异性，又大大降低了鼠源单抗的免疫原性。美罗华(Rituximab)作为第一个用于肿瘤治疗的基因工程抗体，就是由鼠
6、可变区和人恒定区组成的嵌合抗体。但由于嵌合抗体可变区(V)约占整个抗体的30，鼠源性抗体V区中的框架区 (FR)仍残留一定的免疫原性，可诱发HAMA反应。灵长目源抗体也是一类嵌合抗体，通过免疫短尾猿猴产生。由于短尾猿猴抗体的可变区几乎与人可变区无差异，这类嵌合抗体不需要作任何改变，而不致发生抗体反应。Fab和F(ab) ，嵌合抗体的制备原理是将功能性抗体轻、重链可变区基因分别与人抗体的K链和重链CHl恒定区基因进行重组，克隆到表达载体中，构建成鼠一人嵌合的Fab基因表达载体，再转入宿主细胞表达。天然抗体分子重链CHl 和CH2之间的一段铰链区结构，其中的2个Cys残基可以生成二硫键，将2条重链
7、紧密地共价结合在一起。在Fab的C-端额外连接一个Cys残基组成Fab，其表达产物中有痕量蛋白，是以二聚体F(ab)2的形式出现的。1.2 CDR移植抗体(CDR grafted antibody)为了减少鼠源成分，出现了CDR移植抗体或改型抗体(Reshaped Ab)。这是更为完全的人源化抗体，即真正意义上的抗体人源化。抗体中除了3个互补决定区(CDR)是鼠源的外，其余全部是人源结构。如国家I类癌症治疗新药“泰欣生”，即 “泰欣生重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体”，采用了先进的“CDR移植”技术，人源化程度达到95以上，具有更高的安全性和更低的毒性。1.3 SDR移植抗体 (SDR
8、 grafted antibody)CDR移植抗体同嵌合抗体比较，虽然大大减少了鼠源成分，但有时异基因的CDR人源化抗体可能引起抗个体基因型反应。特定决定区(SDR)转移抗体是将异源抗体中与抗原结合密切相关的SDR等少数残基移植到人抗体相应位置上，进一步降低了的异源性。通过这种方法，使人源化的抗体潜在的免疫原性降至最低。1.4 全人单克隆抗体(Fully humaneantibody)1.4.1.抗体库筛选技术1.4.1.1噬菌体表面展示技术(Phage display technology) 随着抗体工程的发展，噬菌体展示技术应运而生，即用PCR技术从生物体内扩增出整套编码人抗体的基因序列，
9、克隆到噬菌体载体上，并以融合蛋白的形式表达到噬菌体表面，从而可以方便地利用抗原一抗体特异性结合进行筛选、扩增。此项技术不仅可以获得具有人体性质的单抗，而且利用抗原直接从库中筛选出所需基因，不需要细胞融合，甚至不经过免疫动物，实验周期短，过程较简单，这是人源抗体制备技术的重大突破。1.4.1.2核糖体展示技术(Ribosome display teclmology)该技术将基因型和表型联系在一起，编码蛋白的DNA在体外进行转录与翻译，由于对DNA进行了特殊的加工与修饰，如去掉3末端终止密码子。核糖体翻译到mRNA末端时，由于缺乏终止密码子，停留在mRNA的3末端不脱离，从而形成蛋白质-核糖-2m
10、RNA三聚体，将目标蛋白特异性的配基固相化，然后进行筛选，对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的mRNA进行RT-PCR，PCR 产物进入下一轮循环，多次循环后可使目标蛋白及其编码的基因序列得到富集和分离。利用此技术可以获得特异性的、高亲和力的抗体.142 转基因小鼠(Transgenetic mouse)在转基因动物方面，有几种不同的途径生产人抗体，其中一种方法是将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的淋巴细胞导入严重联合免疫缺陷小鼠(SCID) 或Trimem 小鼠，取鼠脾细胞与人骨髓瘤细胞杂交就可能获得分泌人抗体的杂交瘤。另一条生产人抗体的途径是通过基因敲除技术，使小鼠自身的基因失活，并
11、导入新基因，创造出携带人抗体重轻链基因簇的转基因小鼠。这种转人抗体基因小鼠所携带的人DNA片段具有完备的功能，可以有效地进行同种型转换和亲和力成熟。任何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力的人抗体。Tomizuka等首先以染色体为载体，成功培育了转染色体小鼠，并制备了高亲和力的人抗体。日本麒麟公司用基因工程技术，使小鼠携带完整的人14号染色体，该染色体包含全部人抗体产生基因。但迄今尚无该技术生产的制品问世。2人源化抗体的表达目前常用的人源化抗体表达系统主要有大肠杆菌体系、酵母体系、昆虫体系和哺乳动物细胞表达系统。21 大肠杆菌表达体系：由于完整的抗体分子是由重链和轻链通过二硫键组装成的
12、有生物功能的免疫球蛋白，而大肠杆菌体系缺少转录及翻译后加工机制，表达的蛋白质不能形成适当的折叠、进行糖基化修饰或正确形成二硫键等，所以不适于完整抗体分子的表达。因而更多的是用来高效表达Fv、Fab及ScFv等功能片段。22 酵母表达体系：主要包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等表达系统。甲醇酵母表达系统是一种最近迅速发展的外源基因表达系统，也是目前应用最广泛的酵母表达系统。巴斯德毕赤酵母系统作为甲醇酵母系统之一，使用得最多、最广泛，该表达系统具有强有力的基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；同时可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达的蛋白具有生物活性，此外该系统具有快速、
13、简单、成本低、表达效率高等优点。23 昆虫杆状病毒表达系统：昆虫杆状病毒表达系统是一种优良的真核基因细胞表达系统。由于昆虫细胞来源广，比较经济，而且具有正确完成蛋白质翻译后加工和糖基化修饰等诸多优越性，已被广泛应于外源基因的表达。但该系统也存在不足之处，即病毒感染会引起细胞的死亡，因此大批量生产有一定的困难。24 哺乳动物细胞系统：该表达系统可以正确地进行翻译后修饰，遗传稳定，成为嵌合抗体最合适的宿主。其中常用的宿主细胞有3种：瞬时表达大多采用非洲绿猴肾(COS)细胞；稳定表达中，骨髓瘤细胞如Sp2O主要用于单抗的高水平表达；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞广泛用于以临床治疗为目的的抗体表达。目前应
14、用这些细胞已成功表达了多种人源化单抗。通过实验还发现，利用转基因小鼠的乳腺细胞也能表达完整抗体，并将抗体分泌到乳汁中。25 植物细胞表达系统：近年来，人们发现植物细胞中也能表达多种形式的抗体，其中包括表达重组人-鼠嵌合抗体。植物细胞中有着与动物细胞相似的蛋白质合成、分泌、折叠及翻译后修饰途径，只是在蛋白质糖基化上与动物细胞略有差异。抗体能在植物的叶子和果实中表达，而不丢失其结合的特异性与亲和力。1999年，Vaquero等报道了采用两个独立的植物表达载体在烟叶中瞬时表达人一鼠嵌合抗体。26 转基因动物表达系统：用于抗体规模化生产时，细胞培养的高成本制约了其应用。利用转基因动物作为生物反应器来生
15、产重组抗体，可以解决这一问题。利用转基因动物制药具有生产成本低、投资周期短、表达量高、与天然产物完全一致、分离纯化容易的优势，尤其适合于一些使用量大、结构复杂的血液因子，如人血红蛋白、人血清白蛋白、蛋白C、纤维蛋白原和抗体等。3人源化抗体的临床应用近年来，人源化抗体和人抗体的出现为临床应用带来了新的希望，当前正处于临床研究的多种抗体中，嵌合抗体和人源化抗体所占比例大于70。目前的人源化抗体，主要用于肿瘤、自身免疫性疾病和心血管疾病的治疗以及抗移植排斥反应和抗病毒感染等方面。31在肿瘤治疗方面的应用单抗药物抗肿瘤能有效地降低传统肿瘤药物治疗的不良反应。这些人源化单克隆抗体的研制主要是针对那些与肿
16、瘤发生、发展相关的靶分子，如治疗非霍奇金淋巴瘤的抗CD20的嵌合抗体Ritu)和抗CD22的人源化抗体Epratuzumab，以及针对肿瘤靶位VEGF、EGFRL、CD33 等开发研制的人源化抗体。这些靶分子在正常组织或细胞中就存在一定的表达，但在许多肿瘤细胞中过度表达，因此可作为肿瘤特异的标志物。还有一些人源化单抗是通过携带抗癌药物如毒素、细胞毒药物、放射性核素、酶、化疗药物等分子而发挥作用。这样偶联而成“生物导弹”，从而达到特异性杀伤癌细胞的作用。32在器官移植中的应用：如何避免和尽可能减轻移植后发生的排斥反应，以保护移植器官的功能，是器官移植成败的关键。近年来，利用抗体药物作为实体器官移植的诱导治疗逐渐增加。如最早批准(1986年) 进入美国市场的治疗性抗体类药物抗CD3单抗即被用于肾、心脏、肝脏移植排斥的逆转。33在自身免疫性疾病方面的应用：在对自身免疫疾病的治疗中，单抗药物通过清除激活的细胞，阻滞其功能，或将升高的促炎细胞因子水平降至正常水平而抑制过度的免疫病理学反应。现有的研究表
