质粒的提取及鉴定

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1、实验六 质粒DNA的少量提取及鉴定 天津医科大学 基础医学院 生物化学与分子生物学系 辛灵彪 目的要求 1.了解质质粒的概念。 2.熟悉提取质质粒的基本原理。 3.掌握碱变变性法提取质质粒DNA的方法。 a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？ 3 1.关于质粒的概念 质粒的定义 质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分 子，能稳定地独立于染色体外，并传递到子代，一般不整 合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。 4 (1) 超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC

2、DNA) (2) 线状DNA (linear DNA, L DNA): 如果两条链均断开，即为线状DNA。 （3）开环DNA (open circular DNA, OC DNA) 如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子 就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的 环状分子。 质粒的三种构型 5 质粒DNA的一般特性： (1)宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多 (2)它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。 (3)质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 (4)它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型： 菌毛、抗药性等 分离纯化质粒DNA的主要步骤 (1)培养细菌使质粒扩增（DN

3、A的扩增与选择） (2)细菌的收集与裂解 v收集方法：高速离心的方法 vv裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法碱变性法、沸水沸水 热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。 根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。纯化方法等因素综合后加以选择。 (3)质粒DNA的纯化 v 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒所有纯化方法都是利用了质粒DNADNA相对较相对较 小及共价闭合环状的

4、性质。小及共价闭合环状的性质。 2 提取大肠杆菌质粒DNA的方法和原则 原理示意图 实验原理： 高碱 细菌的细胞壁破裂，内容物释放 染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA； 线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。 质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状； 双链DNA并不完全分离。 高酸 中和 至中 性 变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物 质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中 纯化 RNA酶消化除去RNA，并用除去残留的蛋白质 试剂盒主要试剂及作用 溶液：由葡萄糖、EDTA、TrisHCl组成.(保护、缓冲) 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度

5、,减少抽提过程中的 机械 剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用) EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对 质粒分子的降解作用。（保护作用） TrisHCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作 用） 10 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性 ) SDS是离子型表面活性剂,其主要作用是：溶解细胞膜上的脂 质与蛋白，从而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；使蛋白 质变性而沉淀下来。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在 接下来的提取过程必须把它去除干净，以便后续更好地进行 。 NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变 性

6、作用）可瞬间溶解细胞及细菌。 11 试剂盒主要试剂及作用 溶液III：pH4.8 KAC(乙酸钾) 高盐溶液，pH调至中性 (复性，分离) 中和溶液的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并 使质粒DNA复性。 KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。 试剂盒主要试剂及作用 吸附株纯化质粒DNA 实验步骤 1.收集4.5ml菌液于EP管，每次12000g30s 2.弃上清，加含Rnase A溶液I 250 l ，剧烈振荡 3.加250l 溶液II，快速颠倒数次 4.加350l 溶液III，温

7、和振荡10s，12000g10min 5.转移500l上清到吸附株，12000g1min 6.吸附柱中加700l漂洗液，12000g1min，弃废液， 将吸附柱放入收集管中。 7.向吸附柱中加入500l漂洗液，12000g1min，弃废 液，将吸附柱放入收集管中。 12000g2min， 8.将吸附柱敞口置于室温放置2min，挥发残余的乙醇。 9.将吸附柱放入一个干净的EP管中，向吸附膜中央悬空 滴加50l经65水浴预热的洗脱液，室温放置2min ，12000g1min。 10.将此质粒DNA溶液置于-20保存。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成

8、的中性物质，不带电荷 。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支 持物进行平板电泳。持物进行平板电泳。 在碱性环境下，在碱性环境下，DNADNA的磷酸基团解离，使的磷酸基团解离，使DNADNA带带负电荷负电荷，在，在 电场中向电场中向正极方向泳动正极方向泳动，因各种因各种DNADNA分子的分子的电荷数、分子量、电荷数、分子量、 构象不同构象不同，在，在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同， 所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。 15 3、质粒DN

9、A的琼脂糖凝胶电泳鉴定 实验材料及试剂 6xloading buffer6xloading buffer：主要成分甘油、电泳指示剂和主要成分甘油、电泳指示剂和tris.tris. 甘油主要负责沉降甘油主要负责沉降DNADNA，避免飞样。指示剂肉眼可见，确，避免飞样。指示剂肉眼可见，确 定电泳状态，一般指示剂两种，溴酚蓝呈蓝紫色，甲苯定电泳状态，一般指示剂两种，溴酚蓝呈蓝紫色，甲苯 晴呈蓝色。晴呈蓝色。 溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）：）：荧光染料，可与荧光染料，可与DNADNA结合，在紫外光照结合，在紫外光照 射下呈红橙色荧光。有致癌性。射下呈红橙色荧光。有致癌性。 TBE:TBE:TrisT

10、ris，Boric acid,EDTABoric acid,EDTA。核酸电泳的经典缓冲液。核酸电泳的经典缓冲液 。 琼脂糖：琼脂糖：用用1xTBE1xTBE配置琼脂糖凝胶。配置琼脂糖凝胶。 DNA markerDNA marker DNA MarkerDNA Marker：是分子量不同的是分子量不同的DNADNA片段，主要用途就是片段，主要用途就是DNADNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否 有问题，以及粗略判断样品的分子量。有问题，以及粗略判断样品的分子量。 DNA Marker DNA Marker应选择在目标片段大小附近

11、应选择在目标片段大小附近ladderladder较密较密 集的集的markermarker，这样对目标片段大小的估计较准确。，这样对目标片段大小的估计较准确。 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素 v1 DNA分子的大小 v2 构象 v3 凝胶浓度 v4 电压 v5 缓冲液 OC 型质粒DNA 点样孔 细菌基因组DNA L型质粒DNA SC 质粒DNA 细菌RNA 质粒电泳图谱 实验步骤 琼脂糖凝胶板的制备 （封板、制备1%凝胶待温度降至60-70时加入EB（0.5/ml ） 、倒胶、插梳、凝固后拔梳） 倒缓冲液，加样 （取质粒DNA样品液 5l + 1 l上样缓冲液，混匀 ） 电泳（100V 2

12、0min左右，5V/cm） 紫外灯下检测 移液器的使用 将微量液体从一个容器转移到另一个容器的计量器具 ，我们称之为移液器。 移液器的使用 移液循环 安装枪头 设定容量 吸液 放液 卸去枪头 移液器的使用 安装枪头 移液器的使用 原点 第一停点 第二停点 勿在液体中按 至第一停点 枪头勿伸入液 面太深 管壁加入排尽液体复位后， 卸去枪头 移液器的使用 卸去枪头 无需用手接触枪头 1、加样枪正确使用； 2、标记自己所提取的质粒类型； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀； 7、使用前请请先检查检查 溶液和溶液是否出现现

13、混浊浊； 8、溶液、溶液和漂洗液使用后应应立即拧紧拧紧 盖子。 9、洗脱液不少于 50l，-20保存，以防 DNA 降解。 质粒提取注意事项： 1.凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定，所 以电泳前应对DNA片段大小有粗略估计。 2.加EB时，胶的温度不要太高。高温会导致EB挥 发，EB有致癌性。倒胶时避免产生气泡。 3.缓冲液要完全没过点样孔。点样孔不能有气泡。 4.紫外线照射不要太久。尤其避免直接照射皮肤。 琼脂糖电泳注意事项： 质粒的定义 质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分 子，能稳定地独立于染色体外，并传递到子代，一般不整 合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超

14、螺旋形式存在。 28 基因克隆示意图 分、切 接 转 筛 实现基因克隆所 采用的方法及相 关的工作统称为 重组DNA技术 ，又称基因工程 。 2 BamHI 、Hind酶切质粒及鉴定 2.1 实验原理： 利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的 核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA 片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴 别目的基因（重组质粒DNA） 33 实验七 质粒DNA质粒DNA的 浓度测定与双酶切鉴定 天津医科大学 基础医学院 生物化学与分子生物学系 辛灵彪 1.熟悉DNA的浓浓度测测定方法。 2.了解限制性核酸内切酶在基因工程中的应应用。 3.熟悉利用限制性核酸内切酶切割质质

15、粒的方法。 目的要求 实验原理 1.质粒DNA浓度测定 1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 OD260的应用 DNA样品的浓度（g/l）= OD260稀释倍数50/1000 OD260/OD280=1.7-1.9 打开紫外分光 光度计，设定 波长260nm,切 换至紫外。 1.质粒DNA浓度测定方法 200倍稀释 样品，10l 质粒加水稀 释至2000l 洗净比色皿， 加入待测样品 。记录260nm 的OD值。 设定波长 280nm，记 录OD值。 计算样品浓 度和纯度 限制性核酸内切酶 定义：能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分 子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。 切割不同来源的DNA分子将产生