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1、食品微生物学检验 致病菌的检验 食品药品检验所 食品微生物学检验 致病菌的检验 食品安全国家标准 微生物常规检验 技术 致病菌的检验 食品安全国家标准 GB 4789.1-2010 食品微生物学检验 总则 GB 4789.2-2010 食品微生物学检验 菌落总数测定 GB 4789.3-2010 食品微生物学检验 大肠菌群计数 GB 4789.4-2010 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 GB 4789.5-2012 食品微生物学检验 志贺氏菌检验 GB/T 4789.7-2008 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验 GB 4789.10-2010 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验 GB/
2、T 4789.11-2003 食品微生物学检验 溶血性链球菌检验 GB 4789.15-2010 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数 GB 4789.18-2010 食品微生物学检验 乳与乳制品检验 GB 4789.30-2010 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特 氏菌检验 GB 4789.35-2010 食品微生物学检验 乳酸菌检验 GB/T 4789.36-2008 食品微生物学检验 大肠埃希菌O157： H7/NM检验 GB 4789.40-2010 食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验 食品安全国家标准 实验室环境应不影响检测结果的准确性。 实验室的工作区域应与办公室区域明显分开。 实验
3、室工作区域面积和总体布局应能满足从事检测工作 需求，实验室布局应采用单方向工作流程，避免交叉污 染。 实验室内温度、湿度、照度、噪声和洁净度等应符合工 作要求。 环境： 食品安全国家标准 一般样品检测应在洁净区域(包括超净工作台或洁净 实验室)进行，洁净区域的应有明显标示。 病原微生物分离鉴定工作应在二级生物安全实验室 (Biosafety level 2 BSL-2) 进行(超净工作台不能替代生物 安全柜)。 环境： 食品安全国家标准 BSL2实验室 食品安全国家标准 参考菌株可以从国际菌种保藏中心如ATCC、国内具 资质菌种保藏中心或室间质控活动中获得，准确鉴定过的 分离株也可使用。 实验
4、室要准备好足够种类和数量的参考菌株，满足培 养基、试剂盒和试剂质量测试的需要。 菌种： 食品安全国家标准 食品安全国家标准 食品安全国家标准 食品安全国家标准 微生物常规检验技术 平板划线分离： 微生物常规检验技术 形态结构观察： 染色特性 形状 大小 排列方式 细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、 芽孢等） 微生物常规检验技术 革兰氏染色： 1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立。革兰染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌 （G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 微生物常规检验技术 革兰氏染色： G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而 且
5、肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了 类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复 合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经石炭酸复红复染后 就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少， 经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低， 因此细菌仍保留初染时的颜色。 微生物常规检验技术 革兰氏染色： 微生物常规检验技术 革兰氏染色： 微生物常规检验技术 细菌的运动性观察： 微生物常规检验技术 细菌的运动性观察： 微生物常规检验技术 设计生化实验的原则： 在实验中加入某些 化学物 质，使细菌代谢途径中 分解代谢产物与加入的化学物质发生反应，产生某些变化或
6、出现某种特征。 微生物常规检验技术 过氧化氢酶及过氧化物酶实验原理： 2H2O2 过氧化氢酶 2H2O+O2 过氧化物酶：RH2+H2O2 过氧化物酶 R+2H2O 阳性：细菌变为黑褐色，有气泡产生； 阴性： 不变色。 阳性 阳性阴性 微生物常规检验技术 细胞色素氧化酶实验原理： 细胞色素C 细胞色素氧化酶 氧化型细胞色素C +对苯二胺 + -奈酚 靛酚兰（蓝色） 阳性： 2分钟内生成蓝色为阳性； 阴性：无变化。 阳性阴性 微生物常规检验技术 氰化钾实验： 阳性： 不抑菌，变混浊 阴性：抑菌 微生物常规检验技术 硝酸盐还原实验原理： KNO3 还原酶 KNO2 KNO2+对氨基苯磺酸+ -萘胺
7、 （立刻或数分钟内 ） 红色化合物 阳性阴性 微生物常规检验技术 糖发酵实验：分解糖产酸，PH值下降，使培养基的酸碱指 示剂发生变化。 阳性：产酸产气 阴性阳性 微生物常规检验技术 氧化发酵实验（O/F实验） ： 有些微生物分解葡萄糖必须有氧参加，此种细菌称为氧 化型； 有些细菌有氧无氧均可分解葡萄糖，称发酵型； 有些细菌任何条件都不能分解葡萄糖，称产碱型。 阴性 灭菌琼脂（厌氧） 微生物常规检验技术 甲基红实验（MR实验）原理 ：一些细菌分解葡萄糖产生丙 酮酸，丙酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸 而使培养基的pH值下降到4.5以下，加入甲基红指示剂出现 红色反应。 微生物常规检验
8、技术 V-P实验原理：一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一步脱羧 产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的 氧氧化成二乙酰丁二酮，进而与培养基内蛋白胨中所含的精 氨酸的胍基发生反应生成红色化合物。 阴性阳性 微生物常规检验技术 柠檬酸盐实验（枸橼酸盐实验）原理： 一些微生物可以以铵盐作为唯一的氮源，以柠檬酸 盐作为唯一的碳源，在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸 盐生成碳酸盐，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色。 阴性阳性 微生物常规检验技术 丙二酸钠实验原理： 一些微生物可以以丙二酸钠作为唯一碳源，分解 丙二酸钠生成碳酸钠，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变 色。 阴性阳性 微生物常规检验技
9、术 马尿酸盐实验原理： 一些细菌可以水解马尿酸生成苯甲酸和甘氨酸，苯 甲酸 和Fe3+反应生成有色的苯甲酸盐沉淀。 阳性 微生物常规检验技术 明胶液化实验原理： 一些细菌可产生胞外酶，使明胶蛋白分解为氨基酸,而 失去明胶的凝固能力。 苯丙氨酸脱氨酶实验原理： 一些细菌有苯丙氨酸脱氨酶，可以使培 养基中的苯丙氨酸脱氨 生成苯丙酮酸，其与 FeCl3反应产生蓝绿色 。 阳性 微生物常规检验技术 氨基酸脱羧酶实验原理： 一些细菌可以产生氨基酸脱羧酶使氨基酸脱酸， 产生胺类物质，使培养基变碱，酸碱指示剂变色。 阳性阴性 微生物常规检验技术 脲酶实验原理： 一些细菌能产生脲酶（尿素酶），可催化尿素分解
10、为氨和二氧化碳，使pH变高，培养基变为碱性，酚红指示 剂变为红色。 微生物常规检验技术 靛基质实验（吲哚实验）原理：一些细菌具有色氨酸酶，可 以分解蛋白胨的色氨酸，产生靛基质，靛基质可与对二甲氨 基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而成红色。 阳性阴性 微生物常规检验技术 ONPG实验（ 检测-半乳糖苷酶）原理： 邻硝基苯-D-吡喃半乳糖苷 -半乳糖苷酶 邻硝基苯酚+ -D半乳糖 阳性阴性 微生物常规检验技术 淀粉酶实验原理： 一些细菌可产生淀粉酶将淀粉分解为双糖或单糖， 加入碘不变色。 接种菌，可 产生淀粉酶 微生物常规检验技术 卵磷脂酶实验原理：一些梭状芽孢杆菌产生卵磷脂酶，经钙 离子作用，能分解卵
11、黄或血清中的卵磷脂产生混浊沉淀状的 甘油酯和水溶性的磷酸胆碱，在菌落周围形成一个乳白色的 沉淀或浑浊带。 乳白色 浑浊带 微生物常规检验技术 脱氢酶实验原理： 一些微生物有脱氢酶，可使氯化三苯四氮唑（ TTC)还原，由无色变为红色。 阳性 微生物常规检验技术 硫化氢实验原理： 一些微生物分解含硫氨基酸（胱氨酸或半胱氨酸） ，产生硫化氢与二价铁盐或铅盐生成黑色沉淀。 阳性 微生物常规检验技术 七叶苷水解实验原理： 一些细菌能分解七叶苷生成七叶素，七叶素与培养 基中的枸橼酸铁的二价铁离子发生反应，形成黑色化合物。 微生物常规检验技术 石蕊牛奶实验原理： 细菌对牛奶的利用分为 ： 产酸及酸凝固 产碱
12、 胨化作用 凝乳酶凝固 石蕊还原 微生物常规检验技术 三糖铁实验（TSI）： 成分：牛肉膏、蛋白胨（氮源） 三糖：葡萄糖0.1%、乳糖1%、蔗糖1% 硫酸亚铁 琼脂 pH值调到7.4 培养基摆成高层斜面 黄 pH7 接种：（1）穿刺接种 （2）斜面划线接种 36oC培养18-24小时 三糖铁实验（TSI）：观察结果。 （1）分解葡萄糖、乳糖、蔗糖：斜面产酸变为黄色（阳性） ，底层产酸变为黄色（阳性）。 （2）分解乳糖、蔗糖，不分解葡萄糖：斜面、底层都产酸变 为黄色（阳性）。 （3）分解葡萄糖、不分解乳糖、蔗糖： 斜面：产碱显红色 （阴性） 底层：产酸显黄色 （阳性） （4）分解含硫氨基酸 产硫
13、化氢 硫化氢与Fe2+生成黑色沉淀， 培养基变黑（FeS）。 （5）分解糖类产气，培养基中有气泡。 微生物常规检验技术 （1）（2）（3） 微生物常规检验技术 血清学实验：抗原与抗体在体外发生的特异性结合反应叫血 清学试验。 抗原：能在体内引起免疫反应的物质 抗体：抗原刺激产生的物质 玻片凝集实验 Ag+Ab Ag+生理盐水（对照） 微生物常规检验技术 生化试验阳性对照菌株阴性对照菌株 靛基质试验大肠埃希氏菌产气肠杆菌 甲基红试验大肠埃希氏菌产气肠杆菌 VP试验阴沟肠杆菌大肠埃希氏菌 尿素酶分解试验奇异变形杆菌大肠埃希氏菌 硫化氢产生试验普通变形杆菌宋内氏痢疾杆菌 苯丙氨酸脱氨酶奇异变形杆菌大
14、肠埃希氏菌 丙二酸盐利用试验肺炎克雷伯菌或亚利 桑那沙门氏菌 大肠埃希氏菌 微生物常规检验技术 生化试验阳性对照菌株阴性对照菌株 赖氨酸脱羧酶鼠伤寒沙门氏菌 或粘质沙雷氏菌 普通变形杆菌 鸟氨酸脱羧酶鼠伤寒沙门氏菌 或奇异变形杆菌 普通变形杆菌 精氨酸双水解酶鼠伤寒沙门氏菌 或阴沟肠杆菌 普通变形杆菌 邻位硝基苯 -D半乳糖苷 大肠埃希氏菌奇异变形杆菌 微生物常规检验技术 生化试验阳性对照菌株阴性对照菌株 明胶液化试验铜绿假单胞菌硝酸盐阴性杆菌 硝酸盐还原试验铜绿假单胞菌硝酸盐阴性杆菌 凝固酶试验（兔血浆 ） 金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌 触酶试验金黄色葡萄球菌肺炎链球菌 胆盐溶菌试验肺炎链球菌绿色链球菌 七叶苷分解试验肠球菌溶血性链球菌 6.5%氯化钠肉汤肠球菌溶血性链球菌 微生物常规检验技术 生化试验阳性对照菌株阴性对照菌株 氧化酶试验铜绿假单胞菌大肠埃希氏菌 氰化钾抑制试验产气肠杆菌大肠埃希氏菌 Dnase试验粘质沙雷氏菌阴沟肠杆菌 杆菌肽试验A群链球菌B群链球菌 致病
