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1、附录A （资料性附录）聚六亚甲基单胍、聚六亚甲基双胍测定方法A.1 方法一：可见分光光度法A.1.1 适用范围适用于含聚六亚甲基单胍、聚六亚甲基双胍的单方消毒剂。A.1.2 原理聚六亚甲基单胍（PHMG）、聚六亚甲基双胍（PHMB）能够与曙红Y(Eosin Y)反应，颜色由橙色变为粉红色，在波长545 nm处测量吸光度值，吸光度值与PHMG、PHMB含量成正比。A.1.3 仪器A.1.3.1 可见光分光光度计，5 cm比色杯。A.1.3.2 分析天平。A.1.4 试剂除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯,实验用水为GB/T 6682规定的一级水。A.1.4.1 聚六亚甲基双胍盐酸盐（PHMB
2、,（C8H17N5）nxHCl）标准品，聚六亚甲基单胍盐酸盐标准品（PHMG，（C7H16N3）nxHCl，可采用纯度大于95%的原料）。A.1.4.2 曙红Y（C20H6Br4Na2O5）。A.1.4.3 三水合醋酸钠（CH3COONa3H2O）。A.1.5 分析步骤A.1.5.1 指示液的制备称取0.6 g曙红Y，放入100 mL烧杯中，以大约50 mL温水溶解并冷却，转移至100 mL容量瓶中，用水定容到100 mL，充分混匀。用移液管吸取10 mL至250 mL容量瓶中，以水定容，得到指示液。A.1.5.2 醋酸钠溶液的制备将10 g三水合醋酸钠溶解于100 mL水中。A.1.5.3
3、PHMG、PHMB标准溶液的制备精密称取PHMG、PHMB标准10 mg，用水稀释至100 mL，得到100 mg/L的标准溶液。A.1.5.4 标准曲线的制备将PHMG、PHMB标准溶液用水稀释成2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L的标准系列，分别吸取10 mL至25 mL容量瓶中，加1 mL醋酸钠溶液和2.5 mL指示液，用水定容至25 mL，用力振摇，充分混匀，分光光度计545 nm处测定吸光值，绘制标准曲线，同时以水做空白实验。A.1.5.5 样品测定称取或量取样品适量，用水稀释至标准曲线浓度范围内，取10 mL样品溶液，按照上述方法测定。A.1.6
4、结果计算根据标准曲线，计算样品的PHMG、PHMB含量，计算公式见式（B.1）。.（B.1）式中：X样品中PHMG、PHMB的含量，单位为克每千克或克每升（g/kg或g/L）；由标准曲线得到样品溶液的PHMG、PHMB的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V样品溶液体积，单位为毫升（mL）；M样品量，克或毫升（g或mL）。A.1.7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。A.2 方法二：紫外分光光度法A.2.1 适用范围适用于含聚六亚甲基双胍的单方消毒剂。A.2.2 原理聚六亚甲基双胍在234nm处有紫外吸收，一定浓度范围内吸光度值与PHMB含量成正
5、比。A.2.3 仪器A.2.3.1 紫外分光光度计，1 cm石英比色杯A.2.3.2 分析天平A.2.4 试剂除非另有说明，实验用水为GB/T 6682规定的一级水。聚六亚甲基双胍盐酸盐（PHMB，（C8H17N5）nxHCl）标准品。A.2.5 分析步骤A.2.5.1 PHMB标准溶液的制备精密称取PHMB标准10 mg，用水稀释至100 mL，得到100 mg/L标准溶液。A.2.5.2 标准曲线的制备将标准溶液用水稀释成2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L、12 mg/L、16 mg/L的标准系列，用1 cm石英比色杯在紫外分光光度计234 nm处，测定
6、吸光值，并绘制标准曲线。A.2.5.3 样品测定称取或量取样品适量，用水稀释至标准曲线浓度范围内，按照上述方法测定。A.2.5.4 注意事项对检测时有干扰的样品，需生产企业同时提供不含PHMB的空白对照样品。A.2.6 结果计算根据标准曲线，计算样品的PHMB含量，计算公式见式（B.2）。.（B.2）式中：X样品中PHMB的含量，单位为克每千克或克每升（g/kg或g/L）；由标准曲线得到样品溶液的PHMB的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V样品溶液体积，单位为毫升（mL）；M样品量，克或毫升（g或mL）。A.2.7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的
7、10%。A.3 方法三：毛细管电泳法A.3.1 适用范围适用于含聚六亚甲基单胍、聚六亚甲基双胍的单方和复方消毒剂，也可以用于鉴别聚六亚甲基单胍和集六亚甲基双胍。A.3.2 原理利用混合胶束电动毛细管色谱（MEKC）可同时分离测定消毒剂中有效成分聚六亚甲基单胍（PHMG）、聚六亚甲基双胍（PHMB）、醋酸氯己定（CHA），以校正峰面积外标法定量。A.3.3 仪器A.3.3.1 毛细管电泳仪，具二极管阵列检测器（PDA）。A.3.3.2 分析天平。A.3.4 试剂除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯,实验用水为GB/T 6682规定的一级水。A.3.4.1 聚六亚甲基双胍盐酸盐（PHMB,（C8
8、H17N5）nxHCl）标准品，聚六亚甲基单胍盐酸盐标准品（PHMG，（C7H16N3）nxHCl，可采用纯度大于95%的原料），醋酸氯己定（CHA，C22H30Cl2N102C2H4O2）标准品。A.3.4.2 四硼酸钠（Na2B4O710H2O，99.5%）。A.3.4.3 氢氧化钠（NaOH）：优级纯。A.3.4.4 硼酸（H3BO3）：优级纯。A.3.4.5 十二烷基硫酸钠（SDS，99%）。A.3.4.6 脱氧胆酸钠（SD，98%）。A.3.4.7 聚乙二醇20 000 (PEG 20 000)。A.3.5 分析步骤A.3.5.1 标准溶液的制备准确称取PHMG、CHA及PHMB各5
9、0 mg，分别置于15 mL塑料离心管中，用移液器加入水10 mL，涡旋混匀，制得质量浓度均为5 g/L的标准储备液，于4冰箱冷藏保存。A.3.5.2 标准曲线的制备分别将PHMG、PHMB、CHA的标准储备液用样品溶液逐级稀释，分别配制成7.5 mg/L、15 mg/L、30 mg/L、60 mg/L和120 mg/L的PHMG的工作液、PHMB和CHA混合工作液。A.3.5.3 分离缓冲溶液20 mmol/L Na2B4O7 +30 mmol/L SDS+5 mmol/L SD+0.8 g/L PEG 20 000。A.3.5.4 样品提取液将分离缓冲溶液用水稀释10倍。A.3.5.5 电
10、泳参考条件毛细管：50.2 cm（有效长度：40 cm）50 m i.d.；分离电压：24 kV；检测波长：214 nm（测定PHMG和CHA）和235nm（测定PHMB）；进样压力及时间：3.448 kPa，12 s；操作温度25。新毛细管在使用前分别用1 mol/L NaOH冲洗20 min，水冲洗5 min，分离缓冲液冲洗5 min。每次进样前依次用1 mol/L NaOH冲洗2 min，水冲洗2 min，分离缓冲液冲洗2 min，以保证迁移时间和校正峰面积的重现性。A.3.5.6 样品测定液体样品用样品提取液稀释后直接进样；消毒湿巾样品则用剪刀剪成细小片，称取1 g，置于50 mL离心
11、管中，加入10 mL样品提取液，超声提取10 min，将提取液转移至另一50 mL离心管中，再加入10 mL样品提取液，重复上述操作，将两次提取液合并、混匀即可直接进样分析。见图B.1。A.3.6 结果计算根据标准曲线，计算样品的PHMB、PHMG、CHA含量，计算公式见式（B.3）。.（B.3）式中：X样品中PHMB的含量，单位为克每千克或克每升（g/kg或g/L）；由标准曲线得到样品溶液的PHMB的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V样品溶液体积，单位为毫升（mL）；M样品量，克或毫升（g或mL）。A.3.7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。图B.1聚六亚甲基双胍的毛细管电泳图A
