实时荧光定量pcr简介、结果分析及报告周向阳

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1、广西临床检验中心 周向阳,实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告,1985年，Kary.B.Mullis教授发明了具有划时代意义的PCR技术。 1993年， Kary.B.Mullis因该技术的发明而获得诺贝尔化学奖。,一、 多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction),PCR反应过程,93 98 变性：加热使双链DNA变为单链。 37 65 退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链 。 70 75 延伸：耐热DNA聚合酶按53方向催化以引物为起始点的延伸反应。,循环次数 DNA的链数 1 21 2 2 22 4 3 23 8 10 210 1024 20

2、220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10亿,PCR特点：高效扩增、忠实复制,PCR技术原理,PCR产物的电泳检测和分析,二、实时荧光定量PCR (Real time Quantitative PCR),定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始浓度进行定量分析的方法。,TaqMan作用机理,每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比,与普通PCR的区别,实时荧光定量PCR应用,病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 基

3、因表达差异分析 亲子鉴定、个体识别 基因分型,三、实时荧光定量PCR结果分析,扩增曲线的认识 结果分析时几个基本概念 数据分析的一般流程 样本复检的一般情况,PCR扩增曲线线性图,扩增曲线线性图谱： 横坐标：扩增循环数（Cycle number）；纵坐标：荧光强度（Delta Rn）。,基线期,指数增长期,线性增长期,平台期,阈值线,CT值,基线期,指数扩增期,平台期,线性扩增期,扩增曲线对数图谱： 横坐标：扩增循环数（Cycle number）；纵坐标：荧光强度（Delta Rn）。,PCR扩增曲线对数图,扩增曲线,线性基线期：指PCR反应处于起始阶段。此阶段，扩增产物很少，所产生的荧光信号

4、很低，反应了系统背景情况。 指数增长期：指PCR达到其最大的扩增阶段，理想条件下，每一循环后，PCR产物呈指数倍增加。 线性增长期：指PCR达到稳定的线性扩增阶段，PCR产物呈几何倍数增加。 平台期：由于原料消耗殆尽，扩增减缓，荧光信号不再随循环数增加而增加。,S型曲线的四个特征性阶段,结果分析时的几个基本概念,基线（Baseline） 阈值线（Threshold） Ct值（Cycle threshold）,基线,基线（Baseline）：扩增曲线中的水平部分。,调整原则：如果Ct值18，不需调整，使用自动分析结果； 如果Ct值18，修改终点，再分析一次； 起点一般取36，终点一般取1215。

5、,阈值线,阈值线（Threshhold）：荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。,手动调节阈值线的原则：要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值。,Ct值,Ct（Cycle Threshhold）值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 Ct 值（ threshold value ）。 PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，是实时荧光定量PCR判

6、断阴、阳性和进行定量分析的依据。,数据分析一般流程,曲线分析（Amplification Plot） 标准曲线分析（Standard Curve） 定值浓度或Ct值,数据分析三部曲,数据分析一般流程,该步骤主要是对扩增曲线进行整体或单个的调整，主要包括：对数曲线与线性曲线的转换、模板或内标检测探针的选择、基线的调整、阈值的设定等几个方面。,曲线分析（Amplification Plot）,数据分析一般流程,对数曲线与线性曲线的转换：一般情况下，我们对实验结果的分析都是在线性曲线基础上进行的，因此在实验扩增结束后，需先将对数扩增曲线转换为线性曲线，以便于后续的分析。,曲线分析（Amplifica

7、tion Plot）,对数曲线与线性曲线的转换,对数曲线,线性曲线,数据分析一般流程,检测通道的选择：该步骤主要是由于多色荧光检测在PCR检测中的应用越来越广泛，比如含有内标的试剂，内标的检测通道与目的基因的检测通道不同，因此需根据需求选择不同的通道进行结果分析。,曲线分析（Amplification Plot）,对数曲线与线性曲线的转换,目的基因：FAM,内标：HEX,数据分析一般流程,基线的调整：其作用直观反应为曲线基线形状的高低或均一性变化。通常情况下，选择自动分析，此时仪器会针对每条曲线进行优化分析，因此效果通常比较好。在基线自动分析的基础上，如果出现某些形状异常的曲线，则在其他结果分

8、析完成后，再单独对异常曲线进行手动基线调整分析。,曲线分析（Amplification Plot）,数据分析一般流程,手动基线设定原则：1.基线的结束点应在进入线性期的前几个循环；2.基线开始点应避开反应开始时不稳定的几个循环；3.基线应选择比较平坦的区域；4.基线设定以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。,曲线分析（Amplification Plot）,自动基线与手动基线,自动分析结果,基线设定为起始值为6，结束值为12,数据分析一般流程,阈值设定：在基线调整后则可进行阈值设定，一般选择人工阈值设定，即通过人为的移动阈值线，到达良好分析效果的目的。阈值的高低直接关系着最后的定量结果的准

9、确性。 阈值设定的原则：阈值线一般置于曲线的指数扩增初期，通常是曲线倾斜程度整体一致的地方。,曲线分析（Amplification Plot）,阈值线的设定,阈值线,三原则：指数扩增初期、整体曲线倾斜程度一致、高于阴性对照的地方,数据分析一般流程,整体曲线的观察：分析是否存在污染（主要是试剂污染）；分析是否有因物理或其他因素造成的异常曲线情况； 阴性对照分析：观察是否存在污染； 阳性对照分析：观察是否在质控范围内； 标准品分析：观察标准品分布是否均匀，梯度是否正常，Ct值是否正常；,曲线分析（Amplification Plot）,数据分析一般流程,该面板主要用于标准曲线参数的分析，通过对曲线

10、各个参数的统计，可以判断实验定量的准确程度或者试剂的稳定程度。其主要包括三个参数：Slope（斜率）、Intercept（截距）和R2（线性相关性）。,标准曲线分析（Standard Curve）,PCR扩增的数学原理,理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0(1+E)n n: 扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产无量 X0：初始模板量 E：扩增效率 等式仅在限定的扩增指数增长期成立。超过此时期后，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增。,实时荧光PCR定量原理,上图为外标定量方法原理图。 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即C

11、t值越小。 标准品与待测样本的扩增效率一致。 Log(浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中的起始模板量。,k=-1/log(1+E),Ct,Log C0,标准曲线分析,斜率、截距、相关性,数据分析一般流程,Slope（斜率）：理论值为-3.32。可以从两个方面来分析，首先是标准曲线的10倍梯度关系，如果梯度正确，斜率数值会比较接近理论值；其次是试剂的扩增效率，当梯度正确的情况下，扩增效率越高越接近理论值。 Intercept（截距）：不同公司的试剂截距有很大的不同，主要是指只有1个病毒扩增时，曲线出现的Ct值。 R2（线性相关性

12、）：指示本次实验标准品的线性关系。 注：优质试剂的标准品每次实验的参数是比较稳定的，做质控分析后偏差应在2SD范围内，Ct值变异系数应小于10%。,标准曲线分析（Standard Curve）,数据分析一般流程,通过上述步骤分析后，可以得到一个比较准确的定量结果或Ct值，如果在上述步骤中没有记录到异常曲线或者情况，则可以发出正确的报告，对于异常的曲线或者情况，则需单独分析，确定复检的必要性。,定值浓度或Ct值,复检的一般情况-失控,阳性质控或阳性样本的失控 阴性质控或阴性样本的失控,失控的一般情况,阳性质控或者样本没有典型的扩增； 阳性质控Ct值或者定值偏差在2SD之外 阳性质控或者样本扩增曲

13、线异常，不呈典型的“S”型，如直线倾斜扩增或者折线型；,阳性质控或样本失控的一般表现,失控的一般情况,核酸提取中的随机误差：如核酸提取过程中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中产生扩增抑制物的残留、所用耗材存在PCR抑制物等； 仪器问题：如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等； 试剂问题：如Taq酶和（或）反转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等；,阳性质控或样本失控的一般原因,失控的一般情况,纯化核酸：但不能完全避免来自标本核酸提取过程中所混入的去垢剂、有机溶剂的抑制作用； 重复性实验：对临床样本进行重复双份测定，避免由于操作的随机性导致结果的误差，同时

14、也可以监测试剂的稳定性； 稀释标本：对于含有已知抑制物的标本如强溶血，则可对标本在扩增前进行稀释，再来测定； 使用“内质控”：即内标，可以避免由于试剂、扩增仪或标本处理不当所致的假阴性，因此卫生部建议使用带有“内标”的检测试剂；,阳性质控或样本失控的预防措施,失控的一般情况,标本间的交叉污染：如在实验过程中，由于操作不当，或者样本采集不当造成的交叉污染； 产物污染：通常指扩增产物泄漏导致的气溶胶污染； 试剂污染：如在提取过程中或配制反应液时造成了试剂污染，从而使得检测结果出现污染；,阴性质控或样本失控的一般原因,失控的一般情况,对实验室进行严格的分区 使用带“滤芯”的吸头 设立“阴性”质控（与

15、标本同时处理） 使用防“污染”（含UNG）的PCR试剂,阴性质控或样本失控的预防措施,假阳性的控制UNG酶+dUTP防污染体系,UNG酶的作用原理：在PCR产物或引物中用dU代替dT。dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UNG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力，其对不含dU的模板无任何影响。,假阴性的控制内标,FAM:525nm,HEX:555nm,目的基因,内标,内标扩增曲线图,内标：已知低含量的与模板扩增效率相似的一段DNA片段，将它加入PCR反应液中，与模板共同扩增，以反应每管真实得扩增情况如果内标和样品都未扩增

16、出结果，则表示该管扩增无效，应重新做。,此外，在圣湘磁珠法中，内标加到提取溶液中，不仅可以监控反应体系是否有效；也可以监控整个提取过程的有效性，同时实现核酸提取过程和扩增过程的监控。,真阴性？！,四、结果报告的要点分析,报告的基本要求 目前报告存在的一般性问题 报告结果：IU与拷贝的含义,报告的基本要求,检测结果的报告应准确、清晰和客观； 定性测定报告“阴性”或“阳性”，定量测定则以“拷贝数/ml”或“IU/ml”报告，避免二者之间的混淆； 每份报告应包括以下信息：标题、唯一标识、检测标本说明、标本特性和状态、标本接收日期和检测日期、检测方法、检测和审核人员签字及发出日期、参考结果或范围； 如对报告有效