《MoFloXDP流式细胞仪简要操作步骤培训用户手册v2》由会员分享，可在线阅读，更多相关《MoFloXDP流式细胞仪简要操作步骤培训用户手册v2（76页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 Beckman Coulter 公司公司 MoFlo XDP 培培 训训 材材 料料 一、培训大纲 二、仪器简介和用途 三、适用范围 四、样本制备方法推荐 五、软件常用操作步骤 六、分选高级技巧 七、触摸屏界面 八、开机、光路和流路检查和清洗 九、分选设置 所有操作步骤和界面说明请参看所有操作步骤和界面说明请参看 INSTRUCTION FOR USE 联系方式 报修电话：021-38651114 应用技术支持：游东生 13636440348 维修技术支持：张洪涛 13601981302 贝克曼库尔特商贸中国有限公司 总机：021-38651000，传真：021-68753929 福山路 5
2、00 号城建国际中心 1201，1208-1210 室 Moflo XDP 用户培训大纲 Moflo XDP 用户培训大纲 装机培训目的装机培训目的 ? 掌握 MoFlo XDP 流式细胞仪分选系统的原理和 结构 ? 掌握流式细胞术标记原理和方法， 掌握样本制 备流程 ? 掌握 MoFlo XDP 开关机程序及常规保养 ? 掌握 Summit 软件获取、分析、分选方法 ? 掌握 MoFlo XDP 光路检查和调节 ? 掌握 MoFlo XDP 分选设置和分选操作 培训内容及时间安排 培训内容及时间安排 第一天： 第一天： 1， MoFlo XDP 流式细胞分选系统的原理和结构 ? 分析和分选原
3、理 ? MoFlo XDP 的结构和特点 2， MoFlo XDP 开关机和保养 ? 开关机程序 ? 消毒程序 ? 鞘液和废液更换方法 3， Summit 软件介绍 ? 建立数据库 ? 菜单 ? 方案建立 ? 调取文件分析 4， 光路检查 ? 准备微球 ? 结果判定 5，细胞标记和检测 ? 抗体介绍 ? 抗体标记的策略和方法 ? 溶血 ? 设门和建立逻辑关系 ? 单色及多色标记的电压和补偿设置 ? 检测结果解读 ? 图形和数据输出 第二天：第二天： 6，分选设置和细胞分选 ? 液滴形成 ? 分选流路 ? 液滴延迟时间确定 ? 分选逻辑选择和设立 ? 分选细胞收集 ? 分选统计结果解读 ? 纯度
4、测定 ? 克隆分选 第三天：第三天： 7，光路校正 ? 激光器光路 ? 流动池位置 ? 更换流动池 ? 鞘液压力调节 ? 激光延迟校正 8，克隆分选 ? 孔板分选 ? 玻片分选 第四天：第四天： 9，全部过程练习 10，答疑 11，培训测试 仪器简介和用途仪器简介和用途 一、 仪器简介和用途一、 仪器简介和用途 Beckman Coulter 公司 MoFlo XDP 是世界上顶级的高速分选型流式细胞仪，可以对样本中特定的细胞进 行定量（所占百分比、单细胞表面相对蛋白表达强度等） ，并对目标细胞进行分选纯化（据标记情况可达 99%以上的纯度） 。分选纯化后的细胞活性高，细胞状态好，可进行下游的
5、细胞培养、功能测定、动物试 验和 RNA/DNA/蛋白抽提等工作。MoFlo XDP 可对样本中任意含量的目标细胞进行分析和分选（国内应 用的下限目前低至十万分之一的目标细胞） ，样本单次获取和保存的细胞量可高达 10 亿个。分选速度为 70000 细胞/秒时仍保持高纯度，硬件丢弃（Hard Abort 或 Electronic Abort）的比例低于 5%，保证样本中 目标细胞的高回收率。 MoFlo XDP 配置为： ? 激光系统 ? 488nm 氩离子固体激光，-200 mW ? UV（355nm）固体激光，100 mW ? 635nm 氦氖激光，25 mW ? 其它激光器（可选） ?
6、滤光片系统 ? 488nm 激光：FSC/SSC/525nm/575nm/620nm/675nm/770nm ? UV 激光：450nm/675LongPass ? 635nm 激光：670nm/750LP ? 其它激光器滤光片 ? 喷嘴大小：70 um，100um 或其它大小喷嘴 ? 样本上样管适配器：0.5 ml 离心管，1.5ml 离心管，12mm X 75mm 普通流式管，15ml 和 50ml 离 心管 ? 分选细胞收集管适配器：0.5 ml 离心管，1.5ml 离心管，12mm X 75mm 普通流式管， 6-1536 孔 板，玻片 ? 可同时进行四路分选、6-1536 孔板单细胞
7、或任意制定细胞数分选、玻片任意矩阵分选 ? 提供上样时温度控制装置和气溶胶防护装置 适用范围适用范围 ? 最佳检测和分选细胞大小范围：0.230 um ? 细胞种类：真核细胞（组织分离细胞、细胞系、大病毒颗粒、细菌、酵母、血液、骨髓、体液细 胞等） ? 可应用的荧光素标记物：FITC / GFP / CY3 / YFP / PE / ECD / PI / PE-CY5 / PerCP / TC / PE-CY7 / APC / APC-CY7/HOECHST 33342 / DAPI / FLUO-2 / FLUO-3 / Alexa Fluo 系列及任何符合上述激 发光及发射光检测滤片的荧光
8、素 ? 主要应用： ? 基于细胞表型的分析分选 ? 基于细胞浆或细胞核（胞内）蛋白的分析分选 ? 基于 DNA 倍体的细胞周期分析分选 ? 基于代谢（如 Side Population ，SP）细胞的分选 ? 常见实验方法：荧光蛋白转染、肿瘤干细胞和其它干细胞、细胞免疫功能、细胞周期、细胞 凋亡、细胞信号传导、细胞器研究等。有标记物的几乎任何细胞的分析分选都可以进行。 样本制备推荐方法样本制备推荐方法 ? 实验准备阶段： ? 目标细胞的 MARKER, 对应的抗体和荧光选择：了解需要检测的目标细胞的特异性标记和 对应的抗体,选择商品化的抗体(荧光标记或未标记,合适的荧光素或二抗) ? 选择合适
9、的荧光和抗体对照 ? 样本处理 ? 必须是单细胞悬液. 外周血和骨髓收集时加抗凝剂即可进行染色,可溶解红细胞或直接进行 检测和分选。. ? 培养细胞需要消化(推荐用混合蛋白酶消化,按照说明书浓度), 过滤和洗涤至少一次后才能 染色.组织样本必须通过研磨成单细胞并过滤后才能进行染色. ? 通常 100-300 目滤网(一次性, 不锈钢或尼龙网都行) . ? 荧光染色 ? 按照 106有效细胞与 1ug 抗体进行染色或按照抗体说明书推荐的量进行。如果商品化抗体指 明实验次数,也要对标本的细胞浓度进行计数. 染色通常室温 30 分钟或冰上 1 小时即可完成, 染色体系体积通常在 100-500ul,
10、可以适量加入去处非特异性染色的 BSA 或其它血清。 部分有 特殊要求的抗体按照说明书进行染色. 避光保存任何加有荧光的样本可以保护荧光素不被 其它因素引起的淬灭。 ? 稀释和过滤 ? 在染色完成后通常加入 PBS 稀释样本至 500-1000ul 备检,在上机前最好再行过滤以防部分 细胞(如肿瘤细胞)聚集成团. ? 细胞分选 ? 如果样本细胞需要分选，保证样本处理和染色过程在无菌环境进行并尽量低温保证细胞活 性，推荐细胞重悬在培养基/生理盐水/PBS ? 尽量浓缩分选的起始样本，推荐起始样本体积 1 ml; 推荐样本中细胞浓度 1 X 108/ml ? 收集分选细胞的试管或多孔板也要无菌，最
11、好使用之前 10% 小牛血清封闭 4 度过夜，使用 前弃去，加入 1 ml 培养液待用 ? 细胞分选所需的时间与样本细胞浓度有关，如果要快速分选，可以减少样本体积，10um 以 下的小细胞适合更高浓度 ? MoFlo XDP 可提供不同的分选要求组合逻辑来满足不同的实验需求 Summit 软件常用操作步骤软件常用操作步骤 1、 开机，点击“Summit”图标，选择相应的数据库或新建数据库， 点击 OK，即打开操作软件； 2、 推荐预热 30 分钟后开始上样检测； 3、 运行光路和流路检查方案（例如 Alignment） ，上标准微球（FLOW-CHECK FOR FL1-FL5， FLOW-C
12、HECK APC FOR FL6-FL7，SPECTRUM ALIGN BEADS FOR FL1-FL9） ，按照说明书进行稀 释，以 100EPS 速度上样分析。检查每个荧光的单参数图的峰的 CV 值。如果大于 488nm 激光器的荧 光第一和第二个通道 CV 值大于 5%，运行系统清洁后再次检测，否则需要优化。 4、 建立 Protocol：File protocol New（新建）或者 Load（使用已有的方案） 。新建的 protocol 可以保存留待下次使用； ? 新建 Protocol 应包括：选择荧光通道及相应得获取参数(signal)，阈值（threshhold，可选择默认
13、数值）,图形（histogram） ，每个通道的电压（Volts） ，补偿（Compensation） ，增益（Gain） ，门 （Region） ，逻辑关系（Gate） ，统计参数（Statistics）等，实际应用中可以逐步来完成，但只有 这些都有了这个方案才算完整。最重要的是电压（用对照来调，调好后设门确定阴阳性的分界 线）和补偿（一定要在电压已经调节好的基础上再调，用单管单标记来调） 。 5、 染色标本：同型对照管（未标记荧光或标记了同型对照的抗体） ，补偿管（分别单标记荧光） ，检测管 （标记所有荧光） ； ? 如果是新建一个测定的方案，一定要按照上述方法染色样本（单色标记可以不要补
14、偿管） ； ? 如果是用一个已经设定和保存好的方案，建议一批次用一个样本来设定上述各管来检查一下方 案的准确性。 6、 调电压：上对照关调节每个通道电压或增益。FSC 和 SSC 调节的目的是要看到样本中所有细胞和部 分碎片，荧光通道上要看到正态分布的阴性峰（单参数图）或阴性群（双参数图） ； ? 对于双参数图，对照管的细胞应该分布在 X 轴和 Y 轴的第一个对数标记 101附近；设立十字门， 让第三象限的细胞百分比98%，第一和第四象限的细胞百分比不为零； ? 对于单参数图，对照管的细胞应该正态峰可见，主要峰形分布在 X 轴的第一个对数标记 101 附近。设立阳性线形门，让门内的细胞的百分比
15、50) appearing in one puddle, and the remainder ( Preferences. Figure 7.37 Edit Preferences The Preferences dialog box appears. 2Ensure that the value in the field next to FCS save max parameter bits is 32. NOTEFloJo 8.43 cannot read FCS files over 16 bits. If you want to analyze data in FloJo, chang
16、e the value to 16. FloJo cannot display any Summit software time parameters. 3Ensure that the checkbox next to Save computed parameters is clear. Figure 7.38 Edit Preferences Sample Settings 4Click Save and Close. 0003262B 7-32 Sorting Setting Up a Sort Run 5In the Summit Software Acquisition tab ensure that the Save Path is de
