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1、 生物化学实验生物化学实验 BiochemicalBiochemical ExperimentExperiment 实验一 比色分析法和分光光度法 孟晓娜 通过生物化学实验应该做到 l学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验 的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合 理地安排实验步骤和时间。 l训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生 物化学实验仪器。 l学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能， 提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进 行所有的实验。 l掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术 ，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参 加科研工作打下坚实的基础。 注意事项 l不许迟到早退。
2、l上课必须穿白大衣。 l实验室内禁止吃东西。 l未经允许，不得随意动实验器材。 l实验后认真打扫卫生。 l按时上交实验报告册。 l遇到问题及时沟通。 成 绩 l理论课（80）+实验课（20）=100分。 l实验课（20） =(报告册+课堂表现)（10）+考试成绩 （10）。 l报告册：书写的认真情况，对实验中出现的问题分析 和看法的总结等。 l课堂表现：是否有迟到早退现象，注意听讲，打扫卫 生等。 内容 3 比色分析法和分光光度法1 比色分析的测定方法2 分光光度计的基本结构与使用 蛋白质的含量测定4 3 比色分析法 l概念：用比较溶液颜色深浅来确定溶液中有色 物质含量的方法 分光光度法 l概
3、念：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别 物质或测定其含量的一项技术。 l特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快 速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检 测出其中所含的微量组分的特点。 基本原理 一.光由几部分组成：3部分 单色光单色光：只具有一种波长的光。 混合光混合光：由两种以上波长组成的光，如白光。 可见光分为哪几个单色光？ 二、物质对光的选择性吸收 白光青蓝 青 绿 黄 橙 红 紫 蓝 1、光的互补性与物质的颜色 物质的颜色物质的颜色是由于物质对不同波 长的光具有选择性的吸收作用而 产生的，物质的颜色由透过光的物质的颜色由透过光的 波长决定波长决定。 例：硫酸铜溶液吸收白光中的黄色光而呈蓝
4、色； 高锰酸钾溶液因吸白光中的绿色光而呈紫色。 如果两种适当颜色的光按一定的强度比例混合可以 得白光，这两种光就叫互为补色光互为补色光。物质呈现的颜色和 吸收的光颜色之间是互补关系。 /nm颜色互补光 400- 450 紫黄绿 450- 480 蓝黄 480- 490 绿蓝橙 490- 500 蓝绿红 500- 560 绿红紫 560- 580 黄绿紫 580- 610 黄蓝 610- 650 橙绿蓝 650- 760 红蓝绿 不同颜色的可见光波长及其互 补光 白光青蓝 青 绿 黄 橙 红 紫 蓝 分光光度法的原理分光光度法的原理 l l Lambert-BeerLambert-Beer定律（
5、光吸收定律）定律（光吸收定律） l l 溶液的质量浓度（溶液的质量浓度（C C）越大，液层厚度（）越大，液层厚度（L L）越厚，则溶）越厚，则溶 液对光线吸收得越多。液对光线吸收得越多。 当入射波长、液层厚度和溶液温度一定时（即当入射波长、液层厚度和溶液温度一定时（即KK吸光吸光 系数为定值），溶液对光线的吸收与溶液中吸光物质的浓度系数为定值），溶液对光线的吸收与溶液中吸光物质的浓度 成正比。成正比。 所以可通过测量溶液的吸光度来求得被测组分的含量。所以可通过测量溶液的吸光度来求得被测组分的含量。 入射光 I I0 0 出射光 I It t 反射光 Ir Ia 吸收光 分光光度法的原理 lLa
6、mbert定律 I0 I 入射光强度 透过光强度 L C 液层层厚度 分光光度法的原理 lBeer定律 I0 I 入射光强度 透过光强度 L C 液层层厚度 分光光度法的原理 lLambert-Beer定律 I It t I I 0 0 T T T T （ transmittance transmittance ）称为透光度称为透光度 ，表示透过光的强度是，表示透过光的强度是 入射光强度的百分比。入射光强度的百分比。 A AC C 光密度与浓度成正比光密度与浓度成正比 T T与与C C成反比，浓度愈大，成反比，浓度愈大，T T愈小愈小 A=A= - Ig - Ig= = KCLKCL T T
7、A A （AbsorbanceAbsorbance）称为称为吸光度，指吸光度，指溶液对光线的吸收程度溶液对光线的吸收程度 又称为光密度（又称为光密度（Optical densityOptical density， OD OD ）。）。 一、波长的选择标准：吸收MAX 干扰MIN 比色分析的测定方法 二、待测溶液浓度的计算方法 1.利用标准管计算测定物的含量 2.利用标准曲线计算测定物含量 3.利用标准系数法求出待测溶液的浓度 4.利用消光系数法求出待测溶液的浓度 利用标准管计算测定物的含量 在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液的吸光度（AS），同时也 测定末知浓度（CU）的吸光度（AU），
8、利用标准曲线计算测定物含量 先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光 度。然后以各管吸光度（A）为纵坐标，各管的浓度（C）为横坐标 ，在方格坐标纸上作图。 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通 过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对末知浓度物质 测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得 测定物的浓度。 标准曲线(浓度-吸光度曲线） 对末知浓度 物质测定时 ，无需再作 标准管，据 测定管吸光 度从标准曲 线上即可求 得测定物的 浓度。 0.2 0.8 0.4 0.6 A C 标准管法 l标准溶液：As=KsCsLs l待测溶液：Au=Ku
9、CuLu lCu=Au/AsCs 实验：实验： 蛋白质含量测定蛋白质含量测定 常用测定方法常用测定方法 1. 1. 凯氏微量定氮法凯氏微量定氮法 2. 2. 紫外分光光度法紫外分光光度法 3. 3. 双缩脲法双缩脲法 4. Folin4. Folin酚试剂法酚试剂法(Lowry(Lowry法法) ) 5. 5. 考马斯亮兰染色法考马斯亮兰染色法 紫外分光光度法紫外分光光度法 l蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有 共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质 ，吸收高峰在280 nm波长处。 l在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值 (OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测 定。 双缩脲法
10、双缩脲法 l碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复 合物（紫色） *Biochemistry Experiments27 FolinFolin酚试剂法酚试剂法(Lowry(Lowry法法) ) 原理原理 Step 1Step 1 碱性条件下蛋碱性条件下蛋 白质与铜作用白质与铜作用 生成蛋白质生成蛋白质 铜复合物铜复合物 蛋白质铜蛋白质铜 复合物使磷复合物使磷 钨酸钨酸磷钼磷钼 酸还原酸还原 蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可使酚试剂中的磷钨酸 磷钼酸还原而呈蓝色 显色反应，蓝色。显色反应，蓝色。A A500 500，540540，650650， ，700700，750750 在一定条件下，蓝色强度与
11、蛋白质的量成正比例。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。 Step 2Step 2 优缺点优缺点 优点优点 缺点缺点 操作简便操作简便 灵敏度高灵敏度高 费时间较长，要精确费时间较长，要精确 控制操作时间，标准控制操作时间，标准 曲线不是严格的直线曲线不是严格的直线 形式，专一性较差，形式，专一性较差， 干扰物质较多干扰物质较多 可检测的最低蛋白质量达可检测的最低蛋白质量达5 g/ml5 g/ml，通常测定范围，通常测定范围 是是25250 g/ml 25250 g/ml ，本次实验标准蛋白含量为，本次实验标准蛋白含量为 1mg/ml(0.1g/%).1mg/ml(0.1g/%). 试
12、验结果的干扰因素试验结果的干扰因素 干扰物质干扰物质 蔗糖蔗糖Tris Tris缓冲液缓冲液 硫酸胺硫酸胺 酚类酚类 尿素尿素 柠檬酸柠檬酸 胍胍 硫酸钠硫酸钠 三氯乙酸三氯乙酸 乙醇乙醇 丙酮丙酮 EDTAEDTA EGTAEGTA Triton X-100Triton X-100 dithiothreitoldithiothreitol 为了消除干扰因素的影响，用已知浓度的标准蛋白质进行实验，绘为了消除干扰因素的影响，用已知浓度的标准蛋白质进行实验，绘 制标准曲线。制标准曲线。 FolinFolin酚试剂法酚试剂法(Lowry(Lowry法法) ) 实验目的实验目的 （1）学习Folin酚
13、法测定蛋白质含量的原理和方法 （2 2）制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量）制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量 一、器材 l1 试管及试管架 l2 移液管(5、1、0.5ml、 0.2ml) l3 可见分光光度计 仪器试剂仪器试剂 l二、试剂（在实验手册中，有配制方法） l1 标准BSA溶液 l2 Fo1in酚试剂 l3 碱性铜液（现用现配制），且注意配制时，要先混合B液再加A液。 l4 0.9% NAcl 分光光度计的基本结构 光源 单单色 光器 吸收池检测检测器显显示 钨丝钨丝灯 可见光源 3501000nm 氢氢灯 氘氘灯 紫外光源 200360nm 棱镜镜 衍射光栅栅 玻璃比色
14、杯 石英比色杯 硒光电电池 光电电管 光电电倍增管 玻璃能吸收UV 光，仅适用于可见 光区。 石英不能吸收 紫外光，适用于紫 外光区。 将光信号转变为 电信号的装置。 记录装置： 讯号处理和 显示系统。 操作步骤：操作步骤： 1.1.开电源预热开电源预热2020分钟分钟 2.2.调波长调波长 3.3.用黑体调用黑体调T T值值( (透光透光 率）为率）为0%0% 4.4.用对照管的溶液调用对照管的溶液调 A A值（吸光率）为值（吸光率）为 0%0%。 5.5.测各浓度的标准蛋测各浓度的标准蛋 白质和血清蛋白质的白质和血清蛋白质的 A A值。值。 分光光度计使用的注意事项 l比色杯应相匹配性（对
15、光的吸收和反射应一致），不得随意挪 用。 l比色杯应持其侧壁的毛玻璃面。 l盛液时达到比色杯的3/4即可，不能太满，外壁如有液体，只 能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。 l测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误后方可倒掉 。 立即混匀，以免产生沉淀。立即混匀，以免产生沉淀。室温下放置室温下放置3030分钟后以分钟后以1 1号试管为空白对照，号试管为空白对照， 在在650nm650nm处比色处比色 操作步骤操作步骤 1.1.标准曲线的制作标准曲线的制作 制作标准曲线：以制作标准曲线：以A650A650为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标 标准蛋白浓度标准蛋白浓度= =标准液标准液(mL)(mL)标准液浓度（标准液浓度（1mg/ml1mg/ml）/1.0/1.0 根据待测血清蛋白根据待测血清蛋白 样品的样品的A A值（值（y y轴）轴） 查找相对应的查找相对应的x x轴数轴数 值求得蛋白质浓度。值求得蛋白质浓度。 0 30 45 60 90 120 ug/ml 双缩脲法 思考题 l1.彩虹的形成 l2.分光光度法的原理依据的是什么定律 l3. folin-酚测定蛋白质的原理是什么 l4.有哪些因素可干扰folin
