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1、Real-time PCR Xiao Jin Applied Specialist Molecular & Cellular Biology Real-time PCR 原理原理 数学原理 化学原理 数学原理 化学原理 Real-time PCR 应用应用 绝对定量 相对定量 等位基因分型 阴阳性判定 绝对定量 相对定量 等位基因分型 阴阳性判定 microRNA 荧光定量PCR数学原理荧光定量PCR数学原理 基线阈值Ct值DNA基线阈值Ct值DNA0 0 同时扩增96的相同样品的结果 由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品 扩增结果存在很大的差异 扩增曲线：四个阶段 线性图谱对数图谱线性图谱
2、对数图谱 平台期 线性增长期 基线期 指数增长期 平台期 线性增长期 基线期 指数增长期 什么是基线？ 基线就是扩增曲线中的水平部分。基线就是扩增曲线中的水平部分。 对数图谱线性图谱 基线基线阈值阈值Ct值值DNA0 1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。 2. 偶然误差的结果满足对数分布。 3. 阈值 = 基线（背景）信号标准偏差 x 10。 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于105。 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。 什么是阈值？ 基线基线阈值阈值Ct值值DNA0 基线阈值基线阈值Ct值值DNA0 什
3、么是CT值？ 从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数 CT值 对数图谱 CT值 线性图谱 lg DNA 循环数 线性期线性期 y = x(1+e)n指数期指数期 为什么CT值 DNA0 ？ N = N0 x (1+e)n N：产物分子数；：产物分子数；N0：起始分子数：起始分子数 e： 扩增效率；： 扩增效率；n:循环次数循环次数 PCR理论方程只在指数期成立 为什么CT值 DNA0 ？ 第第n次次PCR循环时的荧光信号强度循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度等于背景信号强度(RB)加上每个分 子的荧光强度 加上每个分 子的荧光强度(即单位荧光强度
4、，即单位荧光强度，RS)与分子数目的乘积。与分子数目的乘积。 Rn= RB+ X0(1+ e)n Rs RCT= RB+ X0(1+ e)CT Rs lg (RCT - RB) = lg X0 + CT lg (1+ e) + lg Rs CT lg (1+ e) = - lg X0 + lg (RCT - RB) lg Rs 设n=CT，则： )1log( log)log( )1log( log X SBT X O T E RRR E X C + + + = 即CT = - k lg X0+ b（线性方程） 标准曲线：CT值对DNA0作图 CT值 lg 起始DNA CT = - k lgX0
5、+ b 成功的定量PCR 荧光定量荧光定量PCR化学原理化学原理 SYBR Green I作用机理作用机理 1. 每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去 2. 染料一结合，就产生荧光信号 3. 信号强度与DNA分子总数目成正比 数量关系 TaqMan探针的FRET TaqMan Probe EE RQ EE R Q TaqMan作用机理 1. 每产生一条DNA链，就切断一条探针 2. 每切断一条探针，就产生一个单位信号 3. 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比 数量关系 5 TaqMan 探针 上游引物 3 3 5 下游引物 RQ 3 53 5 Q R Real-time PCR
6、 应用应用 绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究 等位基因分型(Allelic Discrimination，AD) 基因突变分析 SNP研究 物种鉴定、菌株鉴定 阴性阳性鉴定(Plus/Minus with IPC，+/-) 实时PCR分析 实时PCR分析 绝对定量绝对定量 绝对定量绝对定量 相对定量相对定量 相对定量相对定量 根据标准曲线 提供数量测量 提供精确的起始材料 相对数量差异 绝对定量与相对定
7、量的定义 绝对定量分析用于确定未知样本中某个核酸序列的绝对量值，即通常 所说的拷贝数。 相对定量用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序 列表达的相对变化。校正样本可以是一个未经处理的对照或者是在一 个时程研究中处于零时的样本。 Log copy number Ct values Cts 01234567 The well contains 400 target copies Y= mx+b 绝对定量：从荧光到拷贝数 相对定量：参照因子 Calibrator t =0 t=12t=24t=48 time total RNA cDNA total RNA cDNA total RNA
8、 cDNA total RNA cDNA 用以比较结果的基准用以比较结果的基准 相对定量：内对照 Endogenous Control t =0 t=12t=24t=48 time total RNA cDNA total RNA cDNA total RNA cDNA total RNA cDNA 用以标准化样品操作用以标准化样品操作 IL-2 18S CtCt2- Ct T=0 (calibrator)2491501.0 T=1hr241014-12.0 T=6hr23 1112-38.0 T=24hr28101830.1 0 2 4 6 8 10 Relative Quantity of
9、 Expression 2.0 8.0 1 t = 0 t = 1 h t = 6 h t = 24 h0.1 相对定量研究软件 同时分析多达10块反应板的基因表达数据 多至960个数据点的单击分析 数据直观 通过CT(比较 Ct)法完全自动分析数据 无须将数据导出至电子数据表或多次数据导出 终点检测终点检测 终点检测终点检测 阴性阳性鉴定 阴性阳性鉴定 等位基因分型 等位基因分型 目标序列的有无 突变的存在形式 等位基因分型 定义：等位基因分型(AD)分析是一种多重（每个反应包括一个以上的 引物和探针对）、终点（在PCR过程的终点收集数据）分析实验，用 于检测某个核酸序列的变异。 每个反应中
10、包括两个引物和探针对，允许在一个目标模板序列的单核 苷酸多态性（SNP）位点上出现两个可能的变异基因型。 目标序列的实际量不确定。 正常与突变探针在同一管里反应的点突变检测 基因分型检测 FAM VIC Homozygote for FAM-specific allele FAM VIC Homozygote for VIC-specific allele FAM VIC Heterozygote for both alleles 等位基因自动识别软件 加速数据分析 等位基因分组识别 每一个孔的质量评分 用户自定义的质量评分 标准 基于每一个标记的识别 限制用户的主观干扰 阴性阳性鉴定 定义：
11、阳性/阴性实验是一种终点分析，它可以确定某个样本中是（阳 性，用加号表示）否（阴性，用减号表示）存在一个特异性目标序列。 在终点分析中，数据是在PCR过程结束时获得的。 什么是IPC？IPC是一种阳性内对照，它被用在阳性/阴性实验中，用 于监测PCR过程并确定阴性结果不是因为PCR失败而造成。，IPC包 括一个模板、一组引物和一个荧光标记（VIC）的探针，被加到反应 板的每一个孔中。 阴性结果示例 阳性结果示例 microRNA MicroRNA(miRNA)是一种 22个碱基左右的内源性单链 小分子RNA 由带茎环结构的双链RNA前 体剪切而成 具有高度保守性、时序性和 组织特异性 通过与特
12、异mRNA结合，抑 制目标基因表达或降解 mRNA miRNA Expression 1.Transcription 2.Hairpin release in the nucleus 3.Export to cytoplasm 4.Dicer processing 5.Strand selection by RISC 6.Translational repression *mature active strand Mechanisms of Small RNA-Induced Gene Regulation 为何研究miRNA？ miRNA已被确认为一类新的基因调控因子，参 与了细胞的发育、分
13、化和联络 对miRNA功能的研究将有助于设计siRNA干扰 实验 miRNA有可能成为新的生物分子标记 有重要的临床应用价值 miRNA 分析的技术挑战分析的技术挑战 Northern Blot (杂交法杂交法) Homegrown technology and easy to access (易于操作) Large sample amount requirement (ug scale) (需大量样品) Low dynamic range (two orders of magnitude) (可测范围低) Mismatch hybridization often cannot disting
14、uish well between miRNAs that only have small sequence differences (错配杂交问题错配杂交问题) Microarrays (芯片法芯片法) High throughput (高产出) Improved dynamic range (可测范围较宽) Large sample RNA requirement, approximately 5 g per array (需大量样 品) Difficult or impossible to distinguish between the Pre-miRNA and miRNA (很难区分
15、前体很难区分前体miRNA and 成熟成熟miRNA) Do not distinguish well between miRNAs that have only small differences in sequence. (对类似结构的miRNA分辨率差) Quantitative Real-Time PCR (实时定量PCR) Dramatically less sample requirement (只需微量样品) Significantly wide dynamic range (7 logs) (非常宽的可测范围) High sensitivity and specificity (高灵敏度, 高特异性) However, how to design a TaqMan real-time PCR assay on a 22 base polynucleotide fragment? (但是, 如何设计这样一个靶物只有22个碱基 TaqMan real-time PCR?) Solution: TaqManMicroRNA PCR Assays Precursor miRNA Mature miRNA Workflow mirVana miRNA Isolation Kit TaqManMicroRNA RT kit TaqM
