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1、生物化学实验 张志红,付永贵 张志红TEL:13922361599 E-mail:lsszzh 付永贵 TEL: 13925119146 E-mail: fuyg 主要内容 绪论 实验室一般规则及实验室安全 实验报告的撰写及实验成绩的评定 本学期实验内容及安排 实验一 蛋白质沉淀、变性反应 3 生物化学实验室规则（1） 1、遵守纪律，不得无故迟到、早退、大声谈笑。 2、预习，熟悉实验目的、原理、步骤。 3、严格听从教师的指导，及时记录实验原始数据。 4、实验场所整洁、公用试剂用后放回原位，实验完毕，清洗 实验器皿、收拾台面，方可离开。 5、注意节约试剂，防止损坏仪器。使用贵重仪器时，严格遵 守
2、操作规程，发现故障，立即报告教师，不得擅自检修。 4 生物化学实验室规则（2） 6、乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，远离火源操作及 放置。 7、所有废液、废弃物等，均收集在指定容器内，不得倒在水 槽内或到处乱仍。强酸和强碱不能直接倒在水槽中，应先稀 释，然后倒入水槽，再用大量自来水冲洗水槽及下水道。 8、室内严禁吸烟！煤气、水管用完即关。 Long hair should be tied back to avoid burns. In addition, avoid wearing loose articles of clothing such as ties or dangling j
3、ewelry that may come into contact with laboratory surfaces. 5 实验室安全-安全用电 使用电学仪器时，要注意电压、电流是否符合仪器的要求， 必要时需使用稳压设备。 严格按照电器使用规程操作，不能随意拆卸，摆弄电器。 严防触电。绝不可用湿手或眼睛旁视时开电闸和电器开关。 检查电器设备是否漏电时，应使用试电笔。凡是漏电仪器一 律不能使用。 6 实验室安全-防止火灾 起火的原因：有电流短路，不安全地使用电炉、煤气灯 和易燃易爆药物着火。 实验必须配备一定数量的消防器材，请按消防规定保管 使用，最重要的是每个实验者都应有实验室安全观念， 时刻
4、保持警惕。 7 实验室内严禁贮存大量的易燃物(如乙醚、丙酮、乙醇， 苯等)。 必须存放的少量即将使用的易燃物，也应将它放在远离 火源处，火焰熄灭后才可大量倾倒这些液体。 低沸点的有机溶剂不准在火焰上直接加热，只能利用带 回流冷凝管的装置在水浴上加热或蒸馏。 实验室安全-防止火灾 8 实验室安全- 防止火灾 2008.03.13 东南大学2007.03.28 兰州理工大学 9 名称 沸点/ 闪点/自燃点/ 乙醚 34.540180 丙酮 5617538 二硫化碳 4630100 苯 8011 乙醇 78 12400 闪点：液体表面的蒸汽和空气的混合物在遇明火或火花时着火的最低温度。 自燃点：液体
5、蒸汽在空气中自燃时的温度。 常见有机溶剂的易燃性 不能放冰箱中储存！不能在火源附近储存、操作！ 10 易燃物蒸汽在空气中的爆炸极限 名称爆炸极限(体积百分数) 乙醚1.936.5 丙酮2.613 乙醇3.319 氢气4.174.2 甲醇6.736.5 乙炔382 实验室内严禁贮存大量的易燃物！ 11 实验室安全-严防中毒 化学试剂有相对无毒、中度毒性和剧毒之分，在处理剧毒 药物时要特别谨慎、小心。国际上常用某些标志标示不同 毒型的化学药品。 使用毒性物质和致癌物必须根据试剂瓶上标签说明严格操 作，安全称量、转移和保管。操作戴手套，必要时戴口罩 或防毒面具，并在通风橱中进行。沾过毒性、致癌物的容
6、 器应单独清洗 、处理。 12 实验室安全-严防中毒 水银温度计、气量计等汞金属设备破损时 必须立即采取措施回收汞，并在污染处撒 上一层硫磺粉以防汞蒸气中毒，注意室内 通风 。 *13 警告标志 有辐射性 安全布告 生物危险品 *14 高度可燃的爆炸性的 危险化学药品标志 有毒的腐蚀性的刺激性有害的 有氧化作用的 *15 氯化钠 优级纯 化学药品的质量标签 *16 氯化钠 分析纯 化学药品的质量标签 *17 氯化钠 化学纯 化学药品的质量标签 18 实验室安全-避免烧伤和创伤 使用玻璃、金属器材时注意防止割伤及机械创伤。 如发生意外，找实验室工作人员(少量急用药物备 用)。 浓酸、浓碱腐蚀性很
7、强，必须极为小心地操作。用 吸量管量取这些试剂(包括有毒物)时，必须使用橡 皮球，绝对不能用口吸取。 19 实验室安全-预防生物危害 微生物、动物的组织、细胞培养物、血液和分泌物 都可能存在细菌和病毒感染的潜在危害，处理生物材 料必需小心谨慎，做完实验必须用肥皂、洗涤剂或消 毒液洗手。 被污染的物品，必须进行高压消毒或烧成灰烬。 被污染的玻璃用具应在清洗和高压消毒前立即浸泡在 适当的消毒液中。 20 实验室急救 1 机械损伤：立即止血，到医院诊治。 强碱：先用大量自来水冲洗，再用5%硼酸溶液或 2%乙酸溶液涂洗。 强酸：大量自来水冲洗，再以5%碳酸氢钠溶液洗涤。 酚： 用酒精洗涤。 煤气中毒：
8、立即到室外，严重者就医。 21 实验室急救 2 玻璃割伤：检查伤口内有无玻璃碎片，硼酸水洗净， 涂擦碘酒或红汞水，必要时用纱布包扎。 烫伤：浓酒精消毒，涂上苦味酸软膏。 触电：关闭电源 用干木棍使电线与被害者分开。 着火： 汽油、乙醚等有机溶剂：石棉布、沙土 电线：切断电源或用四氯化碳灭火器 衣服：勿奔走，湿衣包裹或躺地滚动。 22 实验报告的撰写 实验报告分为以下几部分： 原理 实验步骤 结果与讨论 问答 实验成绩的评定： 实验报告 平时操作、表现 姓名，班级，学号， 课室，实验时间、 实验教师 实验内容及安排 ( 72学时 ) 1、绪论、蛋白质沉淀、变性反应 9月26-27 2、蛋白质浓度
9、测定考马斯亮蓝法 10月10-11 3、 阳离子交换树脂层析分离氨基酸 10月17-18 4、血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 10月24-25 5、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白 10月31-11月1 6、影响酶促反应速度因素最适pH、激活剂（抑制剂） 11月7-8 7、脂肪酶活性的测定 11月14-15 8、过氧化氢酶米氏常数测定 11月21-22 实验内容及安排（续） 9、 糖的定量测定 11月28-29 10、 维生素C的定量测定 12月5-6 11、 脂肪酸B氧化作用 12月12-13 12、转氨基作用 12月19-20 13、鱼类DNA的提取 12月26-27 14、核酸浓度测定UV吸收
10、法 1月2-3 15、聚合酶链式反应（PCR） 1月2-3 16、 DNA的琼脂糖凝胶电泳 1月9-10 一、实验目的 1、了解蛋白质的一些理化性质，认识蛋白质的 可逆反应和不可逆反应。 2、了解蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的 原理及它们的相互关系。 实验一 蛋白质沉淀、变性反应 蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物, 其分子量颇大，介于一 万到百万之间，是一种亲水胶体。 蛋白质分子表面的亲水基团（-OH,-COOH,-NH3,以及肽键）等，在 水溶液中能与水分子起水化作用（Hydration），使蛋白质分子表面形 成一个水化层。每克蛋白质分子能结合0.3-0.5克水。 蛋白质分子表面上
11、的可解离基团，在适当的PH条件下，都带有相同 的净电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。 二、实验原理 由于蛋白质溶液具有水化层和双电层两方面的稳定因素，所以胶体 系统是相当稳定的。 在一定物理化学因素(如盐析、重金属离子、有机酸、无机酸和加热 )影响下,蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，以固态形式从溶液中 析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为两种类型： 1、可逆沉淀反应：蛋白质分子内部结构并未发生显著变化，基本保持 原有的性质，沉淀因素除去后，能溶于原来的溶剂中 。 2、不可逆沉淀反应：蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏， 失去原来的天然性质。 蛋白质溶液的沉淀 稳定是相
12、对的，有条件的。 如果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳 定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。 蛋白质分子表面 水化层 双电层 稳定的亲水胶 脱水，失去电荷 沉淀反应 可逆沉淀反应 （不变性沉淀反应） 如：盐析作用 不可逆沉淀反应 （变性沉淀反应） 如：重金属盐沉淀作用 蛋白质沉淀变性的常见方法 常用方法原理常用试剂实用 盐析 破坏蛋白质胶体溶液的水化层和电荷 层 (NH4)2S04、Na2S04、 Na3P04、NaCl、MgS04 常用此法来分离和纯化蛋白质。 有机试剂盐 析 脱水作用；降低水的介电常数和蛋白 质溶解度；蛋白质析出 乙醇、丙酮、甲醇 低温乙醇提取血液中的蛋白质组 分 强酸、强
13、碱 沉淀 破坏蛋白质分子结构发生蛋白质变性 盐酸, 硫酸, 硝酸、氢氧 化钠 灭活病毒 加热变性鸡蛋、肉类等加工 重金属盐沉 淀 变性；生成不溶性盐Ag+，Hg2+，Cu2+和Pb2+ 临床上常用蛋清或牛乳解救误服 重金属盐的病人 有机酸沉淀生成不溶性盐 苦味酸、鞣酸、三氯醋酸 、磺基水杨酸等生物碱试 剂 沉淀蛋白滤液等 三、实验材料及设备 蛋白质溶液：取10ml鲜鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100ml ，搅拌后用4-8层纱布过滤，新鲜配制。 蛋白质氯化钠溶液：取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱 和氯化钠溶液l00ml，充分搅匀后用4-8层纱布滤去不溶 物（加氯化钠的目的是溶解球蛋白）。 1.
14、材料 2. 试剂 3%硝酸银，0.5%乙酸铅，10%三氯乙酸溶液，饱和硫酸铵溶液， 10%氢氧化钠溶液，浓盐酸，浓硫酸，浓硝酸，5%磺基水杨酸 ，0.1%硫酸铜，饱和硫酸铜溶液，0.1%乙酸，10%乙酸，饱和 氯化钠溶液，硫酸铵粉。 3. 器材 水浴锅,漏斗,滤纸,吸管,试管及试管架,量筒等。 四、实验内容 1. 蛋白质的可逆反应蛋白质的盐析 步骤现象解释结论 取一支试管，加入3mL蛋白质氯 化钠溶液和等量的饱和硫酸铵溶 液，混匀，静置10分钟 观察有无蛋白质（ 球蛋白）的沉淀 过滤后，向滤液中加入硫酸铵粉 末，边加边用玻璃棒搅拌，直至 粉末不再溶解，直至饱和 观察有无沉淀（清 蛋白）析出 静
15、置，弃去上清液，取出部分清 蛋白，加少量蒸馏水 观察沉淀的再溶解 操作现象操作现象 Tube 11mL蛋白质溶液 3-4滴3%硝酸银溶液 过量的硝酸 银 Tube 21mL蛋白质溶液 1-3滴0.5%乙酸铅 过量的乙酸 铅 Tube 31mL蛋白质溶液 3-4滴0.1%硫酸铜 过量的硫酸 铜 2. 蛋白质的不可逆反应 2.1. 重金属离子沉淀蛋白质（3支试管） 操作现象 Tube 10.5mL蛋白质溶液 数滴10%三氯乙酸溶液 Tube 20.5mL蛋白质溶液 数滴5%磺基水杨酸 2. 蛋白质的不可逆反应 2.2 有机酸沉淀蛋白质（2支试管） 操作现象操作现象 Tube 115滴浓盐酸 沿管壁加入6滴蛋白质溶液， 勿摇 振荡 Tube 215滴浓硫酸 沿
