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1、WS/T 中华人民共和国卫生部 发布-实施-发布白细胞分类计数参考方法Reference leukocyte differential count method（报批稿）WS/T WS中华人民共和国卫生行业标准ICS备案号：1目 次前言1 范围42 总则43 方法43.1样本采集43.2血涂片制备和要求43.3血涂片染色43.4需分类的外周血有核细胞53.5血涂片检查步骤53.6检验人员要求和考核6附录A（规范性附录）常见外周血白细胞形态学7附录B（规范性附录）计算公式9附录C（规范性附录）自动白细胞分类计数的性能评价10参考文献16前 言为了保证白细胞分类计数结果具有溯源性和准确性，特制定本
2、标准。本标准修改采用了美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）颁发的白细胞分类计数参考方法和仪器评价方法标准（H20-A）。本标准从20XX年XX月XX日起实施。本标准的附录A、附录B和附录C都是规范性附录。本标准由卫生部医政司提出。本标准由上海市临床检验中心负责起草。本标准主要起草人：胡晓波、许蕾、宋颖、方心驰、张锦锋。本标准由卫生部委托卫生部临床检验中心负责解释。III白细胞分类计数参考方法1 范围本标准规定了建立白细胞分类计数参考方法中有关样本采集、血涂片制备的要求、血涂片染色、血涂片有核细胞检查的步骤、对检验人员的要求和考核等内容。本标准适用于建立白细胞分类计数参考方法的实验室2
3、总则2.1 本标准采用手工目视显微镜计数法作为白细胞分类计数的参考方法。2.2 为了保证参考方法检测结果的精密度和准确性，建立参考方法的实验室必须进行比对。3 方法3.1 样本采集将静脉血采集于EDTAK2抗凝剂（液体或粉末状）中（浓度为每毫升血液含1.52.2mg EDTAK2H2O）。采血后立即混匀，应拒绝分析有肉眼可见凝块的样本。3.2 血涂片制备和要求3.2.1 血涂片制备3.2.1.1 每份样本制作3张血涂片。要求所用玻片清洁、干燥、无尘，大小为25 mm75mm，厚度为0.81.2mm。并有明确标记。如果样本中白细胞数量少时，需要制备更多血涂片（如6张）。3.2.1.2 使用EDT
4、AK2抗凝血液样本时，应在采集后4小时内制备血涂片。在制片前，样本应充分混匀。注意，样本不能冷藏。3.2.1.3 用楔形技术制备血涂片。在玻片近一端1/3处，加一滴（约0.05ml）充分混匀的血液，握住另一张较狭窄的、边缘光滑的推片，以3045角使血滴沿推片迅速散开，快速、平稳地推动推片至玻片的另一端（见图1）。3.2.1.4 在1小时内，用Romanowsky类型染液染色；或在1小时内，用无水甲醇（含水量3%）固定后染色。3.2.2 良好血涂片的要求3.2.2.1 血膜至少长25mm，至玻片两侧边缘的距离至少为5mm。3.2.2.2 血膜边缘要比玻片边缘窄，且边缘光滑，适用于油镜检查。3.2
5、.2.3 血细胞从厚区到薄区逐步均匀分布，末端呈方形或羽毛状。3.2.2.4 血膜末端无粒状、划线或裂隙。所有这些情况会使白细胞集中在这些区域内。3.2.2.5 在镜检区域内，白细胞形态应无人为异常改变。通常，随着保存时间的延长，抗凝血会造成白细胞形态的改变，如胞浆内形成空泡，核分解破裂等。应将抗凝血液保存时间的影响减小到最低限度。除部分淋巴细胞增生性疾病外，镜检区域内破损白细胞量应2。3.2.2.6 无人为污染。3.3 血涂片染色采用Romanowsky类染料染色。Romanowsky类染料由亚甲蓝和/或亚甲蓝氧化产物（天青B），和卤化荧光素（通常为伊红B或Y）组成。良好的染色能准确鉴别成熟
6、和未成熟白细胞或异常细胞。3.3.1 染料的性能Romanowsky类染料的质量直接影响染色效果。在pH6.47.0条件下，染料与细胞中特定成分（细胞核和细胞浆特殊颗粒）相互作用，产生典型的颜色，如细胞核染深紫色，红细胞染鲜亮的橙红色。3.3.2 可接受的染色情况粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和其他细胞必须能显示清晰的核浆分界，能识别核染色质成分和细胞浆的颜色差异。3.4 需分类的外周血有核细胞外周血可见多种有核细胞。常见的有：中性分叶核粒细胞、中性杆状核粒细胞、淋巴细胞、异型淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。外周血中正常白细胞的形态描述见附录A。外周血中少见的其他有核细胞在专业的血
7、液学教科书和图谱中均有描述，本标准中不再叙述。3.5 血涂片检查步骤3.5.1 血涂片显微镜检查3.5.1.1 首先在低倍镜下（10倍40倍）进行浏览，观察有无异常细胞和细胞分布情况。然后，在100倍油镜下，观察细胞浆内的颗粒和核分叶情况。3.5.1.2 检查从约50的红细胞互相重叠区域开始，向红细胞完全散开的区域推移。血涂片较薄的区域，呈羽毛状，为“血片边缘”。3.5.1.3 中性粒细胞，单核细胞和淋巴细胞分布均匀的区域为血涂片分类“可接受”区域。当白细胞总数正常时，在血涂片尾部和边缘，每油镜视野所见的白细胞数量不超过血涂片体部的23倍。3.5.1.4 除某些病理情况（如慢性淋巴细胞白血病）
8、外，破碎细胞或不能识别细胞的数量不超过白细胞总数的2%。若破碎细胞仍能明确鉴别（如破碎的嗜酸性粒细胞）应包括在分类计数中。在结果报告中，应设其他栏，以备填写破碎细胞或不能识别细胞，并作适当描述。3.5.2 计数方法3.5.2.1 采用“城垛式”方法检查血涂片（图1）。每个明确识别的细胞必须归入下列分类中：中性分叶核粒细胞；中性杆状核粒细胞；淋巴细胞；异型淋巴细胞；单核细胞；嗜酸性粒细胞；嗜碱性粒细胞；其他有核细胞（除有核红细胞外）。能明确识别的破碎细胞，应恰当分类。血涂片体部的检查区域血涂片头部，涂片太厚血涂片尾部，涂片太薄血膜至玻片一端约为总长1/3血涂片A001血膜至玻片边缘约5mm 红细
9、胞分布较疏 红细胞分布较密图1 外周血涂片制作方法和“城垛式”血涂片检查方法3.5.2.2 每张血涂片应计数200个白细胞，若样本中白细胞数量减少，应增加检查血涂片的数量。3.5.2.3 白细胞分类结果以百分率和绝对值表示。3.5.2.4 计数所有的有核红细胞，结果以每100个白细胞计数中见到几个表示。3.6 检验人员要求和考核3.6.1 检验人员的要求3.6.1.1 检验人员的经验检验人员必须能对所有常见白细胞进行分类，并了解大多数白细胞的形态异常，包括先天性和获得性。参与细胞形态学检查的检验人员必须进行专业培训，并具备实际工作经验。3.6.1.2 检验人员的态度检验人员的工作态度、动机和专
10、心程度是关键因素。因为白细胞分类计数是一项主观性很强的工作，影响分类计数的因素很多，有检验人员的态度、实验室环境条件和工作量等。对于以每张血涂片计数200个白细胞的参考方法工作量来说，每天每个检验人员血涂片检验数量约为1525张。3.6.2 血涂片考核3.6.2.1 考核样本选择10份样本。样本必须包含7种类型白细胞（中性分叶核粒细胞、中性杆状核粒细胞、淋巴细胞、异型淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）。其中，至少有一份样本含有少量有核红细胞，一份含有少量未成熟白细胞。按照3.2要求，每份样本制备5张血涂片，按照第3.3节所述方法染色，统一标签，但检验人员不知道样本来源。玻片分成5
11、套，每套包含10份样本的玻片各1张。3.6.2.2 检验人员考核分发给参加检验的人员一套考核血涂片，要求每张血涂片做200个白细胞的分类计数，并根据血涂片编号，报告结果，交给监考人。监考人计算每份样本每种细胞的均值，进行结果解释，制作每种类型细胞分布图。其中横坐标（X轴）为组均值（百分率），组均值为实验室具备资格的检验人员计数的均值。纵坐标（Y轴）代表检验人员个体的结果。在图上添加两条代表理论上95和99可信区间的线条，由计数百分率的标准误算得，计算公式见附录B。3.6.2.3 解释根据Gaussian分布假说，5的个体结果可能会超出95范围，但不会超出99的限值。若数据不符合该规则，表示存在
12、样本处理过程或操作错误（如样本标签错误，制片不佳，读片区域不当或细胞分类错误）。在分析出可能误差来源后，必须重新进行考核。若不能符合统计学规则，应高度怀疑结果的有效性。监考人必须仔细地检查每张图形。检验人员数值应该呈随机分布。若非如此，评价中可能引入了检验人员的偏倚。应该采取纠正措施（如培训或更换人员等），并重新进行考核。应保留一套考核血涂片作为标准片，用于其他检验人员的培训和考核。（规范性附录）常见外周血白细胞形态学外周血常见有下列5种类型白细胞。形态特点的简单描述如下。A.1 中性粒细胞，分叶核A.1.1 细胞大小为1015m。A.1.2 细胞核与细胞浆比率为1:3。A.1.3 细胞呈圆形
13、或卵圆形。A.1.4 细胞核分叶，叶间有丝状连接，分为25叶。A.1.5 核染色质聚集。A.1.6 无核仁。A.1.7 细胞浆染成淡粉红色，含大量特异性颗粒。A.2 中性粒细胞，杆状核A.2.1 细胞大小为1018m。A.2.2 细胞核与细胞浆比率为1:1.51:2。A.2.3 细胞呈圆形或卵圆形。A.2.4 细胞核呈S形，C形,U形或分叶形，可见峡状染色质。A.2.5 核染色质粗颗粒状聚集。A.2.6 无核仁。A.2.7 细胞浆丰富，染成粉红色；含大量特异性颗粒，罕见嗜天青颗粒。A.3 淋巴细胞A.3.1 细胞大小为715m。A.3.2 细胞核与细胞浆比率为5:12:1。A.3.3 细胞呈圆形或卵圆形。A.3.4 细胞核通常呈圆形或卵圆形；偶见核凹陷或轻度切迹。A.3.5 核染色质散在致密或粗颗粒状聚集；副染色质无或少量。A.3.6 无核仁；有时，可见小的、淡的核小体。A.3.7 细胞浆少至中等量；淡蓝色至中度嗜碱性；可见核周淡染区；有时有副核窝；小淋巴细胞无颗粒；大淋巴细胞的细胞浆较多，含少数粗大嗜天青颗粒。A.4 淋巴细胞，异型A.4.1 细胞大小为1025m。A.4.2 细胞核与细胞浆比率为3:11:2。A.4.3
