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1、生物系统中mRNA或DNA等目标核酸分子的分析鉴定 必须回答如下三个基本问题： 目标核酸分子是否存在于实验标本中。 实验标本中目标核酸分子的含量是多少。 实验标本中目标核酸分子的序列如何；以及与其他实验标本 中的情况比较，目标核酸分子的序列是否有变化。 核酸实验研究技术进展1 1 证明目标核酸分子是否存在于实验标本中的基本实验方法： 1）杂交法，2）PCR法，3）测序法。 核酸实验研究技术进展1 2 1)杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针。 qDot blotting：不经过电泳，直接把检测样本点在一个适宜载体 上，针对目标DNA分子或RNA分子进行杂交检测。 qSouthe
2、rn blotting：在电泳后，针对目标DNA分子的杂交检测。 qNorthern blotting：在电泳后，针对目标RNA分子的杂交检测。 q目标DNA分子原位杂交检测。 q目标RNA分子原位杂交检测。 核酸实验研究技术进展1 3 杂交法的优点与缺点： q优点： Dot blotting：简单实用，适于进行大样本数同时检测。 Northern blotting：如果检测结果阳性，其可信度要远远高于 RT-PCR，因此被誉为评价基因转录的Golden Marker。 Southern blotting：对DNA病毒类病原体等的检测实用性很强。 q缺点： Dot blotting：由于在同一
3、斑点位置，除了目标核酸分子 外，同时还存在其它的成千上万种不同的核酸分子，而这些核酸 分子有可能会与探针分子部分结合，这会促进探针分子与目标核 酸分子的结合，因此将可能导致阳性结果放大，甚至是假阳性结 果。 Northern blotting：对低拷贝mRNA有时检测不出来，容 易导致假阴性结果。 核酸实验研究技术进展1 4 例一： cDNA microarray 检测SHEEC食管 癌细胞NGAL基因 mRNA转录实验 结果 反向 Dot blotting 核酸实验研究技术进展1 5 例二： Northern blotting检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL基因 转录mRNA实验 结果
4、NGAL 化学发光法 核酸实验研究技术进展1 6 例三： Northern blotting 检测缺 氧复氧条件下心 肌细胞EGR1基 因转录mRNA 实 验结果 EGR1 同位素法 核酸实验研究技术进展1 7 确保杂交法实验成功的八个关键点： q关键点1：确保实验方案设计合理。 q关键点2：确保探针的特异性充分。 q关键点3：确保检测的灵敏度足够高。 q关键点4：确保样本质量合格。 q关键点5：确保实验试剂质量合格。 q关键点6：确保实验过程规范。 q关键点7：对于编码序列的cDNA，要确保没有RNA的干扰。 q关键点8：几种杂交法，或杂交法与其它方法联合使用，相互印证 ，确保实验结果可靠。
5、 核酸实验研究技术进展1 8 2)PCR法：序列已知，同时还要合成一对特异性引物。 核酸实验研究技术进展1 q优点： 实验的灵敏度很高，理论上可检测实验生物系统中 所存在的1个拷贝目标核酸分子。 阴性结果的可信度很高 。 q缺点：由于容易存在样本污染情况，与此同时，毕竟在实验 过程中存在着目标核酸分子拷贝数人为放大这样一个事实， 因此，其阳性结果的可信度不如Northern boltting 或 Southern boltting。 9 例子： RT-PCR检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL基因 转录mRNA实验 结果 NGAL 600bp S M S: 食管癌细胞SHEEC M: DNA
6、marker 核酸实验研究技术进展1 10 核酸实验研究技术进展1 确保PCR法实验成功的八个关键点： q关键点1：确保实验方案设计合理。 q关键点2：确保引物的特异性充分。 q关键点3：确保样本质量合格。 q关键点4：确保实验试剂质量。 q关键点5：确保实验过程规范。 q关键点6：确保PCR变性、退火和延伸温度适度。 q关键点7：对于编码序列cDNA，要确保没有RNA的干扰。 q关键点8：几种PCR法，或PCR法与其它方法联合使用，相互印证， 确保实验结果可靠。 11 核酸实验研究技术进展1 3)测序法：通过电泳等手段已知实验生物系统中目标核酸的大 致大小，而且是对照生物系统中不存在，或者两
7、者相比在含 量上可能有显著差别，然而序列未知。 q优点： 可信度最高。 对于解析鉴定未知核酸分子序列片 段是必需的手段。 q缺点：目标片段边缘序列的测定结果有时不准确，在读原初 测序图时要格外小心。 12 核酸实验研究技术进展1 目标片段边缘序列的测定结果有时不准确例子 13 Poly A tail 核酸实验研究技术进展1 14 核酸实验研究技术进展1 15 核酸实验研究技术进展1 测定实验标本中目标核酸分子的含量 16 核酸实验研究技术进展1 通过 Dot blotting，结合斑点光密度扫描分析 ，测定实验标本中目标mRNA分子、目标cDNA分子 或目标DNA分子的含量 17 A 永生化食
8、管 上皮细胞 SHEE B 食管癌细胞 SHEEC 例子：cDNA microarray （反向 Dot blotting） 检测 SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果 判断标准： B/A 2或 0.5为显著性 差异表达 实际情况： B/A3.53 核酸实验研究技术进展1 18 核酸实验研究技术进展1 通过 RT-PCR，结合条带光密度扫描分析，测定实验 标本中目标mRNA分子或目标cDNA分子的含量 19 例子：RT-PCR 检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮 细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果 NGAL 6
9、00bp A B M A: 永生化食管上皮细胞SHEE B: 食管癌细胞SHEEC M: DNA marker A B M GAPDH 226bp 核酸实验研究技术进展1 20 两个问题： 反转录PCR实验是否需要探针 ？ 反转录PCR的特异性如何保证 ？ 核酸实验研究技术进展1 21 核酸实验研究技术进展1 通过 Northern blotting，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标mRNA分子的含量 22 例一：Northern blotting 检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮 细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果（化学发光） NGAL A B A:
10、 食管癌细胞SHEEC B: 永生化食管上皮细胞SHEE A B GAPDH A BA B 500 - 400 - 300 - 200 - 100 - 100 - 80 - 60 - 40 - 20 - 核酸实验研究技术进展1 23 核酸实验研究技术进展1 例二：Northern blotting 检测缺氧复氧条件下心肌细胞EGR1基 因转录mRNA 相对含量实验结果(同位素标记法) 1 正常 2 缺氧复氧 3 缺氧复氧溶剂对照 4 缺氧复氧F2 5 缺氧复氧钙离子拮抗剂 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 EGR1 -Actin 24 核酸实验研究技术进展1 通过 Southern bl
11、otting ，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标DNA分子的含量 25 核酸实验研究技术进展1 通过 Southern blotting ，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标DNA分子的含量 26 核糖核酸酶保护分析（Ribonuclease Protection Assay，RPA ）是一种 较好的mRNA定量检测技术。 RPA的各项实验指标均优于Northern Blotting。 运用RPA可实现对目标RNA分子的高通量定量检测。 核糖核酸酶保护分析 Ribonuclease Protection Assay (RPA) 核酸实验研究技术进展1 27 原理： 以目标
12、基因DNA为模板，利用32P-（放射法）或生物素（非放 射法）作为标记信号，体外转录合成反义RNA探针。 将过量的反义RNA探针与样品总RNA杂交，然后进行核糖核酸 酶处理。未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针被降解， 而目标RNA则因与探针结合形成双链而被保护。 杂交双链进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用放射自显影或化学 发光等方法确定目标RNA的量。 核酸实验研究技术进展1 28 核酸实验研究技术进展1 29 核酸实验研究技术进展1 适时荧光定量PCR Real time fluorescent quantitation PCR 30 适时荧光定量PCR与常规PCR的本质区别 常规PCR技
13、术：对PCR扩增反应的终产物进行定性定量或半 定量分析 适时荧光定量PCR技术：通过一个特殊的荧光探针，对PCR 扩增反应中每一次循环的产物进行适时跟踪定量分析 核酸实验研究技术进展1 31 real time PCR 的扩增曲线 核酸实验研究技术进展1 32 PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图 Ct值极具重现性 核酸实验研究技术进展1 33 Ct与初始模板的关系 固定循环数后，荧光信号值 与模板数成正比 固定荧光信号值后，循环数 与初始模板数成反比。初始 模板数越多, 荧光信号达到 阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板浓度的对数与Ct呈 线性关系，根据样
14、品的Ct值 就可计算出样品中所含的初 始模板数。 Threshold 104103102 核酸实验研究技术进展1 34 常用的定量PCR荧光探针 SYBR Green I Taqman水解探针 分子信标 核酸实验研究技术进展1 35 SYBR Green I v 结合到双链DNA的小沟部位 v 只有和双链DNA结合后才发荧光 核酸实验研究技术进展1 36 SYBR Green I 工作原理 未结合的SYBR green I 核酸实验研究技术进展1 37 SYBR Green I的优点 价格相对便宜 使用简便 可以用于不同的模板 灵敏度很高 SYBR Green I的缺点 特异性较差 核酸实验研
15、究技术进展1 38 TaqMan Probes 荧光素 淬灭剂 与目标序列互补 FAM TET JOE HEX VIC TAMRA DABCYL 核酸实验研究技术进展1 39 TaqMan Probes工作原理 探针与目标序列配对 ，荧光基团与荧光淬灭 剂相邻，不发生特异荧光 光光 能量转移 Taq 游离的探针 荧光基团 淬灭剂 延伸时，Taq酶水解探针，荧光基团与荧 光淬灭剂分离，发出特异荧光。 Taq 发出特异荧光 光 另一波长的荧光 核酸实验研究技术进展1 40 TaqMan Probes的优点： 定量关系准确。随着扩增循环数增加，TaqMan探针 释放出来的荧光基团成倍增加，荧光强度与扩增产 物的数量呈正比关系。 TaqMan探针特别适合于病毒定量、基因转录水平定 量、癌细胞基因微突变检测等。 敏感性高。 特异性高。 TaqMan Probes的缺点： 只适合于一个特定目标的检测。 核酸实验研究技术进展1 41 分子信标 (发夹型杂交探针) 荧光基团 茎由互补配对的序 列组成 环与目标序列互补 淬灭剂淬灭剂 茎茎(5-7bp) 环（15-30bp） FAM Texas Red 核酸实验研究技术进展1 42 分子信标
