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1、犬瘟热及其诊断与防制 预防兽医 犬瘟热（canine distemper，CD）是CDV引起的犬科、 鼬科和浣熊科等动物的一种急性、热性、高度接触性传染 性疾病。以早期表现双向热、急性鼻卡他以及随后的支气 管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征。犬 感染CDV的死亡率可达90%，甚至90%以上。 犬瘟热最早发现于18世纪后叶。1905年卡尔（carre） 发现其病原为病毒。我国于1968年首次在黑龙江一野生动 物饲养场发现犬瘟热。截至目前,世界各国凡是有犬科动 物生存的地区都有本病发生。 随着CDV对动物流行因素的不断适应,其自然感染宿主 范围在不断扩大,加之CDV变异株的出现,犬瘟热
2、的发病率 和致死率仍居高不下,流行趋势由散发向群发发展,临床症 状越来越复杂,其危害也越来越大。 此外,最新研究证实CDV在体外可感染人的前体破骨细 胞,在破骨细胞内增殖,表明CDV的自然宿主可能已扩展到 了人类。鉴于上述因素,国际动物卫生组织(OIE)始终将其 作为重点关注的疫病之一。 主要内容 n一、病原与流行病学 n二、发病机理与主要临床特征 n三、诊断技术 1、胶体金免疫层析技术 2、RT-PCR和核酸探针技术 3、包涵体检查 4、血清学技术 5、病毒分离 n四、CD的防制 一、病原与流行病学 病原 CDV属副黏病毒科，麻疹病毒属，CDV基 因组为不分节段的单链负股RNA,由15616
3、个核苷酸 组成。CDV由6个基因组成,从3端到5端依次为 N、P、M、F、H、L，分别编码核衣壳蛋白、磷酸 化蛋白、C蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素蛋 白和大蛋白七种主要蛋白分子。 N蛋白1-80或337-358多肽是CDV刺激机体抗体 的B细胞表位。CDV N蛋白的281-289氨基酸即Tyr- Pro-Ala-Gly-Leu-His-Gln-Phe连续9个氨基酸残 基高度保守，是T细胞表位，能诱发MHC-I类抗原 限制性CTL反应，在细胞免疫中发挥重要作用。研 究表明N蛋白与CDV的毒力密切相关。 F蛋白介导病毒与感染细胞、感染细胞与非感染细胞的 融合,使病毒具有在体内扩散的能力,同时,
4、还担负着刺激 机体产生中和抗体的职能,在抗病毒免疫中具有重要地位 。在麻疹病毒属（MV）成员中,MV、CDV和牛瘟病毒（RPV ）有群特异性表位,主要是在F蛋白上,F蛋白存在高度的表 位同源性,是异型免疫的主要交叉抗原，故可产生交叉免 疫。 目前研究认为犬瘟热病毒只有一个血清型。但由于 CDV可能具有丰富的基因多样性,存在着不同的变异毒株 。大量研究显示,目前流行的野毒株与标准的Covac、 Rockborn、Onderstepoort、Lederle等疫苗株的抗 原性、致细胞病变类型(CPE)、毒力等生物学特性方面存 在部分差异。 本病毒在-10可生存几个月，在-70或冻干条件下 长期存活；
5、在0 以上感染力迅速丧失;最适PH7.0,对热和 干燥敏感，0.1%甲醛或1%煤酚皂等对本病由消毒效果 流行病学 传染源 患犬瘟热病动物、潜伏期带毒动物及 病死尸体是主要的传染源。CDV为一种泛嗜性病毒 ，但亲嗜性最强的淋巴细胞和上皮细胞。CDV大量 存在于感染和患病动物的唾液、眼和鼻分泌物中, 也见于淋巴结、肝脏、脊髓、血液、脑脊液、心 包液及胸腹水中。患犬瘟热的犬是最危险的传染 源,许多报道显示多数养殖场发病与本场内或附近 居民的患病犬有关,因此,毛皮动物养殖场如需要 护场犬时,应对进行其定期免疫。患病痊愈动物带 毒期可长达6个月,此间,仍可通过其排泄物和分泌 物中排出病毒,污染周围环境。
6、 传播途径 试验表明，犬瘟热主要传播途径为 通过消化道、呼吸道以及粘膜直接接触传播。若 与病毒携带者直接接触,或接触污染的饮水、饲料 、垫草、食具、用具、饲养人员的工作服、手套, 兽医人员的体温计、注射器及注射针头等,均可感 染此病。犬瘟热也可通过鼠类、禽类、吸血昆虫 以及风等媒介作用间接传播。CDV还可通过胎盘进 行垂直感染。 易感动物 CDV自然宿主谱十分广泛，目前 己知可自然感染CDv的动物包括食肉目所有8个科 、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科 等多种动物。犬最易感，凡是养犬的地方都有本 病的发生，特别常见于城市或犬类集中地的方。 不同年龄、性别和品种的犬都可感染，但2月龄以
7、内的幼犬由于母源抗体的保护，80%不受感染；3- 12月龄的幼犬易感性最高；2岁以上犬的易感性逐 渐降低。康复犬可获终身免疫力。 二、发病机理与主要临床特征 n发病机理 感染后病毒主要从鼻咽和呼吸道 散布到支气管淋巴结和扁桃体进行原发性 增值，产生初始毒血症，同时伴有第一次 体温升高，此时病毒散播到网状内皮系统 。在淋巴器官增殖的病毒被淋巴细胞及单 核细胞携带进入血液，产生第二次病毒血 症，伴有第二次体温升高。CD病例CBC可 见WBC计数下降，后可因继发感染导致 WBC升高。 临床症状与病变 CDV为一种泛嗜性病 毒（与机体细胞广泛存在CDV受体有关）病变分 布广泛，但亲嗜性最强的淋巴细胞和
8、上皮细胞 。肺脏、肝、脾、骨髓、上皮细胞组织以及全 身淋巴结和淋巴器官是病毒易于定居之所,病理 上表现为呼吸道、肺部和消化道不同程度的卡 他性炎症,重症病例肺部充血性水肿和坏死性支 气管炎,肠系膜脱落,肠系膜淋巴结肿大。病理 组织学检查,在呼吸道、膀胧、肾孟上皮细胞中 可见到包涵体。 临床上犬瘟热主要表现的症状：1.眼鼻有 浆液性或脓性分泌物；2.呼吸道症状，如咳嗽 、流鼻涕等；3.双向热；4.血便；5.神经症状 ，抽搐，角弓反张等。 有些病例皮肤出现水疱性皮疹、有些病例鼻和 脚底表皮角质层增生而呈角化病。CDV主要侵害易 感动物的呼吸系统、消化系统以及神经系统。由 于受动物免疫状态、野毒株毒
9、力强弱差异等因素 影响,感染CDV后动物临床症状不尽相同,在临床上 可将犬瘟热分为呼吸型、消化型、神精型和混合 型四种症候型,这四种症候型既可以独立出现,又 可两种或三种混合在一起。此外犬瘟热的发生常 与犬传染性肝炎、犬细小病毒及其他细菌感染并 发或继发,使病情变得更为复杂。 三、诊断技术 n病毒分离 n胶体金免疫层析技术 nRT-PCR和核酸探针技术 n包涵体检查 n血清学技术 胶体金免疫层析技术 胶体金免疫层析法 胶体金免疫层析技术是 20世纪90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的 一种简易快速的检测技术, 由Beggs等最先用于人 绒毛膜促性腺激素(HCG ) 的测定，用于人的妊娠 检查
10、。近年来该技术发展迅速, 在生物医学领域特 别是医学检验中得到了广泛应用。 目前，胶体金技术广泛用于小动物传染病如 ：CDV、CPV、CAV（传染性肝炎）、CCV、FPV （猫泛白细胞减少症）、FeSV（猫白血病）、FIV（猫免 疫缺陷病）等疾病的快速筛选诊断。 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下, 可聚合成一定大小 的金颗粒, 它带负电而且疏水, 由于静电作用金颗粒和水 成为稳定的胶体状态称胶体金。 胶体金标记技术, 实质上是蛋白质等高分子物质被吸 附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗 粒表面带负电荷, 与蛋白质的正电荷基团因静电吸引而形 成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸
11、制备各种不同 粒径, 也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对 蛋白质有很强的吸附能力, 可以与葡萄球菌A 蛋白、免疫 球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋 白等非共价结合, 因而在基础研究和临床实验中成为非常 有用的工具。显微镜下金标蛋白结合物呈黑褐色颗粒, 当 这些标记物在相应的配体处大量聚集时, 肉眼可见红色或 粉红色斑点, 因而目前金标被应用于定性或半定量的快速 免疫检测方法中。 n 例：CDV抗原胶体金快速诊断试纸 胶体金免疫层析技术 所应用的主要技术类型是双抗体夹心法。如主要是将CDV 抗体以条带状包被在NC膜的检测线T上,胶体金标记的CDV 抗体吸附在结合垫上,
12、 当待测样品加到试纸条一端的加样 孔上后, 通过毛细作用向前移动, 溶解结合垫上的胶体金 标记的CDV抗体,如果样品中含有CDV,则形成金标CDV抗体- CDV抗原复合物， 再移动至包被的CDV抗体的检测线（T） 处, 包被在检测线上的CDV抗体和金标CDV抗体与样品中的 CDV结合, 形成金标CDV抗体-CDV抗原-CDV抗体复合物, 胶 体金富集在检测线处形成一条可见的紫红色线。 如果待检血清中没有相应抗体, 胶体金标记物将不会 与包被在检测线上的抗体结合, 胶体金不会富集, 检测线 上不会出现紫红色色线。当样品与溶化了的胶体金标记物 继续往上移动至对照线（质控线C）时, 就与包被在对照
13、线处的抗金标抗体结合, 在对照线上形成免疫复合物, 出 现一条胶体金富集的紫红色色线。试纸条如上图所示。 金标抗体 金标抗体-抗原 -抗体复合物 抗金标抗体-金标 抗体复合物 （吸水玻璃纤维） 包被抗体处 玻璃纤维素膜 吸水纸 包被抗金标抗体处免疫胶体金抗体包被处 RT-PCR RT-PCR 逆转录-聚合酶链式反应方法具有 特异、敏感、快速诊断等优点。提取组织或细胞 中的总RNA，以其中的RAN作为模板，采用特异性 引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模 板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表 达，再进行电泳检测。 如王凤雪,闫喜军等以CDV 疫苗株N蛋白基因为研究对 象,
14、建立的CDV的RT-PCR检测方法用于毛皮动物犬瘟热诊断 。 P1( 5GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA3) ; P2 ( 5CTTGAGCTTTCGACCCTTC 3) 1.TRIzol法抽取总RNA 2.病毒cDNA的合成 反转录( RT) 20uL反转录反应体系：反转录引物P2 1uL、RNA 5uL、70加热10min、冰浴10min，再加入5倍 PCR buffer 4uL,2.5mmol/L dNTP2uL, RNAisn抑制酶 0.5uL,AMV反转录酶1uL, DEPC H2O 4.5uL, 充分混合后离 心,经4260min,95灭活AMV反转录酶,立即于
15、冰上冷却, 进入PCR。 3.PCR反应体系：PCR反转录产物5uL, 10 倍PCR buffer 5uL, 2.5mmol/ L dNTP4uL,上、下游引物各1uL, rTaq DNA Polymerase 1uL, 加水补足50uL。PCR 的反应程序: 94 45s, 51.6 45s, 72 45s, 35 个循环后, 72 延伸5min。取10uL PCR产物,以100bp Ladder作对照, 进 行1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测。 4.结果判定：琼脂糖凝胶电泳，在阳性对照孔出现 相应扩增条带，而阴性对照孔无此条带时判定结 果。若样品扩增条带与阳性对照扩增条带处于同 一位置，则判定为CDV阳性，否则为阴性 n包涵体检查 可刮取鼻、舌、结膜、瞬膜或刮取膀胱、肾盂、胆囊和胆管等粘膜， 做成涂片，干燥，甲醛固定，苏木紫和伊红染色后镜检。包涵体红色 见以胞浆内，一个细胞内可能有1-10个，平均2-3个，椭圆形或圆形 ，边缘清晰。发现包涵体可以作为诊断依据，但要与细小病毒的核内 包涵体区别。有时仅仅根据包涵体的存在可能导致假阳性诊断，最好 还要进行病毒分离鉴定或血清学检查。 CPVCDV 血清学技术 n血清中和试验：将备检血清稀释后加入标准病毒 株，25作用2h，与制备好的犬肾或绿猴肾细胞 悬液混合接种于微量培养板，5%CO2条件下35- 36
