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1、生物素-亲和素放大技术 王强 川北医学院医学检验检验 系 E-mail：wqiang_1981 主要内容 生物素-亲和素系统简单介绍 BAS基本类型和反应原理 生物素和亲和素放大系统的应用 对不起，哥是重点！ 了解 了解 一、生物素-亲和素系统（BAS） 一) 生物素及活化生物素 二) 亲和素及链霉亲和素 三) 生物素-亲和素系统的特点 一）生物素及活化生物素 (一)生物素 1 概念： 生物素(biotin)是动、植物体内广泛 分布的一种小分子生长因子，又名辅酶 R或维生素H。 2.分子式： C10H16O3N2S 分子量：244.31 3.结构： （CH2）4COOH 结合亲和素 结合蛋白质
2、 咪唑酮环 噻吩环 why why why 为什么 要对生物素 进行活化？ 为什么 要对生物素 进行活化？ 我 是 生 物 素 我 可 以 是 抗 体 ， 也 可 以 是 酶 我是亲和素，我来了 Broken Heart 我是亲和素，我来了 1）生物素分子较小，与蛋白质结合后，由 于大分子蛋白质的空间位阻效应，可影响生物 素与亲和素间的结合； 2）生物素只能依靠肽键与蛋白质上的氨基 结合。 因此，活化生物素可克服以上缺点，既减 少空间位阻效应，又可扩大其结合的对象。 (二)活化生物素 生物素与蛋白质的结合 v1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯（ BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。
3、 v2.标记蛋白质醛基：酰肼（BHZ）和肼化生物 胞素（BCHZ）。 v3.标记蛋白质巯基：3-（N-马来酰亚胺-丙酰 ）-生物胞素（MPB）。 v4.标记核酸：光生物素、生物素脱氧核苷三 磷酸、BNHS和BHZ。 v1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯（ BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。 抗体中性和偏碱性 蛋白的标记 v2.标记蛋白质醛基：生物素酰肼（BHZ）、肼 化生物胞素（BCHZ） 用于偏酸性糖蛋 白的生物素标记 v标记对象： 大分子活性物质：如抗原、抗体。标记后 不影响免疫活性。 酶：如HRP、葡萄糖氧化酶和ALP等。会降 低ALP的活性。 (三)生物素标记蛋白质 v活
4、化生物素可与不同的大分子物质结合，应 根据可标记基团的种类及特性，选择相应的 活化生物素； 抗体：BNHS 偏酸性抗原：BHZ 核酸：光生物素 v一个蛋白质分子可联结多个生物素分子，即 生物素化大分子具有多价性，它是BAS多级 放大作用的物质基础。 v但每个蛋白质上标记的生物素分子数量应控 制在一定范围。 每个抗原标记1-3个生物素分子为宜； 每个抗体标记3-5个生物素分子为宜； 生物素：IgG(mg/mg)=2:1，效果较好。 一、生物素-亲和素系统（BAS） 一) 生物素及活化生物素 二) 亲和素及链霉亲和素 三) 生物素-亲和素系统的特点 二）亲和素和链霉亲和素 v(一) 亲和素(avi
5、din，A) 1.概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳 水化物的碱性糖蛋白。 2.分子量：68 000 3.结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白， 富含色氨酸，它是与生物素结合的基团。 A 4.特性：每个亚基都可结合1个生物素分子， 即1个亲和素分子可结合4个生物素分子。 5.亲和常数：1015/mol 6.缺点：由于是碱性蛋白（PI=10），且含糖 基，与聚苯乙烯的非特异性吸附较高，会 导致本底增大，降低检测灵敏度。 二）亲和素和链霉亲和素 v(二)链霉亲和素(streptavidin，SA) ： 1.概念：是从链球菌属的菌培养液中提取的 一种蛋白质。 2.分子量：65 000 3.结构
6、：由4个相同的肽链组成，甘氨酸和丙 氨酸含量较大 。 4.特性：1个亲和素分子可结合4个生物素分 子。 5.亲和常数：1018/mol 6.优点：为弱酸性蛋白（PI=6.0），不含糖基 ，因此与聚苯乙稀的非特异性吸附远低于 亲和素，因此应用广泛。 SA v标记对象： 大分子物质：如酶、抗原和抗体。 小分子物质：胶体金、FITC和化学发光物 等。 二）亲和素和链霉亲和素 (三 ) 亲和素的标记 一、生物素-亲和素系统（BAS） 一) 生物素及活化生物素 二) 亲和素及链霉亲和素 三) 生物素-亲和素系统的特点 三）生物素-亲和素系统的特点 1.特异性强： 亲和素和生物素间的高亲和力。 2.灵敏度
7、高： 每个亲和素分子可与四个生物素结合； 生物素化大分子具多价性。 3.快速、稳定： 4.应用广泛： 可与酶、荧光素、胶体金等多类标记技术结合； 可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹心法 、间接法、竞争法等，在此基础上引入A-B系 统。 vBAB法： vBA法： vABC法： 二、 BAS的基本类型及原理 1BAB法： AbB A AbB-A B AbB-A-B 特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E；AbB 和A-B的两次放大效应，可提高灵敏度。 +A+A+ BAB法在夹心ELISA中的应用 2BA法： AbB A AbB-A 特点：省略加标记生物素步骤，操作较BAB 法简便；AbB的放大效
8、应，该法有相当 高的灵敏度。 +A-E BA法在间接ELISA中的应用 3ABC法： A+B A- B -ABC Ag+AbB Ag-AbB ABC Ag-AbB-ABC 特点：是在BAB法基础上的改良，将BAB法中的A 先与B-E结合，制备成复合物ABC；操作比 BAB法简便，但仍然保持较高的灵敏度。 + +ABC B-E + A ABC ABC法在夹心ELISA中的应用 v1、BAS在酶免疫技术中的应用 v2、BAS在荧光免疫技术中的应用 v3、BAS在放射免疫技术中的应用 v4、 BAS在分子生物学中的应用 三、 生物素-亲和素系统的应用 免疫-PCR 免疫PCR是在ELISA的基础上建
9、立起来的新方法， 用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色。 PCR具有很强的放大能力，其可以定量地检测DNA 和RNA，具有非常高的敏感性和特异性，因此，将与 抗原结合的特异抗体通过连接分子与DNA结合，再经 PCR扩增，由此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和 RIA。 免疫-PCR 一、主要程序 1. 抗原+生物素化抗体抗原-生物素化抗体复 合物； 2. 加亲合素抗原-生物素化抗体-亲合素复合 物； 3. 加生物素化DNA抗原-生物素化抗体-亲合 素-生物素化DNA； 4. PCR扩增生物素化DNA部分。 PCRPCR扩增原理扩增原理 引物引物 延伸延伸 延伸延伸 5 5 5 5 3
10、3 3 3 变性、退火变性、退火 变性、退火变性、退火 PCRPCR技术具有高度的灵敏性技术具有高度的灵敏性 3030轮循环轮循环 扩增量达扩增量达2 230 30个拷贝（ 个拷贝（1010 9 9 拷贝拷贝 ） PCRPCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍 二、免疫PCR的发展 v免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，应用的 还不多； v实验表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍 ，且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到 几百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以 检测到一个分子抗原，因此，免疫PCR特别 适用于检测一些含量特别少的抗原分子。 A Monoclonal-Antibod
11、yEnzymeImmunoassayfor Detection of HepatitisB Surface Antigen with Use of a Biotin-Avidin System CLINICAL CHEMISTRY, 1985,31(2):202-205 Definition of Three Serotypes of Hantaviruses by a Double Sandwich ELISA with Biotin-Avidin Amplification System J. gen. Virol. 1985, 66, 1733-1740. 双抗体夹心生物素亲和素ELISA法检测相思子毒素 免疫学杂志,2007,23(5):571-574
