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1、基础生物学实验基础生物学实验( (四四) ) 细胞遗传及无菌操作 实验教师 助教 实验技术员 黄蓓 胡玲 刘康武 王丽丽 吴东明 谭阳 魏军 陈勤 张蓓蕾 李燕斐 孙敏 细胞生物学实验 实验一 临时制片法 3 黄蓓 实验二 细胞膜的通透性观察 3 黄蓓 实验三 叶绿体的分离与观察 3 黄蓓 实验四 线粒体的超活染色与观察 3 黄蓓 实验五 植物组织培养技术 6 陈勤 实验六 孚尔根染色 3 查向东 实验七 果蝇系列实验 3 尹若春 实验一、细胞多样性观察-临时制片法 【目的要求】 1、熟练掌握三种临时制片方法。 2、掌握油镜的使用方法 3、注意观察细胞核和细胞质及质膜、细胞壁 的形态(洋葱)。
2、 【实验材料】 1、洋葱内皮细胞 2、口腔上皮细胞 3、人血细胞 4、碘液：IKI5%乙醇配制而成。 5、0.85%灭菌的生理盐水 6、普通显微镜、擦镜纸、载玻片、盖玻片、压舌 板(消毒)、滴管及滴帽、香柏油、二甲苯、消毒的 注射针头、刀片、小镊子、棉花球。 A Typical Animal Cell A Typical Plant Cell 普通光学显微镜 显微镜的分辨率与放大倍数 3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 D = 0.61/ NA = 0.61/sin/2 其中为入射光线波长；NA为镜口率 sin/2，n=介质折射 率；=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 思考：如何提高显
3、微镜的分辨能力？ 表一、几种介质的折射率 显微镜的几个光学特点 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.651.78，所用介质的折射率越接 近玻璃的越好。 sin /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.050.95 ；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 普通光线的波长为400700nm，分辨力数值不会小于0.2m，人眼 的分辨力为0.2mm。 【操作方法】 1、取洋葱块茎，用刀片切下0.5 cm大小的小块时 ，小心用镊子夹住内皮，轻轻撕下，置于载玻片上 ，然后加2滴碘液，510min后，盖上盖玻片，同 时用吸水纸拭去过多的碘液，随后置于显微镜下观 察。 2、滴2滴碘液于载玻片上
4、，然后将压舌板于口腔两 侧（任一）轻轻刮取口腔上皮细胞，于碘液上适当 涂抺，最后盖上盖玻片。 人血细胞涂片 3、一般从人的耳垂或指尖取血。先将采血的耳垂 或指尖用碘液和75%酒精消毒，用经过灭菌的刺血 针扎破耳垂或指尖皮肤，让血液流出，除去第一滴 后采样。在灭菌载玻片右面13处滴血一滴。取另 一张载玻片做为推片，让推片的一端与血滴接触， 并与血滴玻片成350400夹角。待血液沿着两块载 玻片接触线向两边扩散后，将推片保持夹角，向血 玻片左侧均速推进，血液随推片而行，在血玻片上 形成一层血膜，即为血涂片。在血滴前推时，根据 所滴血量多少，适时停推，盖上盖玻片。 4、显微镜观察方法 标本置于载物台
5、上-先于低倍镜（10）观察- -高倍镜（40）-上抬1cm -加香柏油到标本上-调节镜头（100）， 并使之埋入油中 -适量调节粗、微调焦螺旋至看清材料-镜 下观察，并绘图； 实验结束，上升镜筒-滴加二甲苯-用擦镜纸 擦拭镜头-将显微镜恢复原位，放入镜箱 注意事项与作业 【注意事项】 1、做血涂片时，应该注意：推片的边缘要平滑。推血 膜时，用力要均匀，保持角度，中途不能停止。若停止再推 ，血膜产生波纹，薄厚不均。推血膜时，如血滴大、角度 大，速度慢，易出现较厚的血膜，对观察不利。 2、做刮取口腔上皮细胞前，应超前漱口，以防残留的食物 渣影响镜下观察。 3、油镜使用完毕后，应及时用蘸有二甲苯的擦
6、镜纸擦拭干 净，以免油镜受到污染。 【作业】 1、绘图表示观察到的几种细胞形态（请标明放大倍数）， 并注明属何种制片法？ 实验二、细胞膜的通透性观察 【目的要求】 1、 了解细胞膜对物质通透性的一般规律。 2、 了解溶血现象及其发生机制。 Typical plasma Membrane Erythrocyte Membrane Skeleton 电镜下的红细胞 实验原理 细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透 性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出 细胞。水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照 物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透 压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。 将红细胞放
7、在低渗盐溶液中，水分子大量渗到 细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中， 由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶 液，这种现象称为溶血。 扩散与渗透 水的渗透同样是从自 由能高的地方向自由 能低的地方移动，如 果考虑到溶质的浓度 ，水是从溶质浓度低 的地方向溶质浓度高 的地方流动。 红细胞膨胀与收缩 将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于 红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧 的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现 象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作 为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本 实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料 ，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞 的变化。 限
8、制因素 脂溶性 细胞质膜的通透性具有选择性。 Size ： 质膜的通透性孔径不会大于0.5-1.0nm，能够扩散的最小分子是水 分子。 Polarity 极性物质通常同水结合形成一个水合的外壳，这不仅增加了它们 的分子体积，同时也大大降低了脂溶性。 脂溶性的、分子量小的、非极性物质易通过细胞膜 实验用品 1、材料：普通显微镜、普通离心机、扭力天平、 10ml试管、10ml刻度离心管、试管架，2ml注射器（ 无需针头）或5ml移液管、洗耳球、滴管、载玻片、 擦镜纸、记号笔。 2、试剂：0.128mol/L NaCl溶液、0.128mol/L NH4Cl溶液、0.128mol/L NH4AC溶液、
9、0.128mol/L NaNO3溶液、0.09mol/L Na2SO4溶液、0.24mol/L葡萄 糖、0.24mol/L甘油、0.24mol/L 乙醇、0.24mol/L 丙酮、0.128mol/L KNO3溶液、蒸馏水。 3、材料：鸡血细胞。 操作方法 1、取鸡血lml，用O.128molL的NaCl溶液 9ml洗涤3次(每次洗后需1000 rmin离心 5min),最后配成30%的红细胞悬液。 2、取11支试管，按附表中所示测试溶液，分 别取样各3ml，作出标记后，各管均加入红细 胞悬液2滴，混匀后静置于温室中，观察各支 试管中发生溶血的时间及其变化。 【观察结果】 1、试管内液体分两层
10、：上层浅黄色透明， 下层红色不透明为不溶血（），镜检红细 胞完好呈双凹盘状。 2、如果试管内液体混浊，上层带红色者， 称不完全溶血（或），镜检有部分红 细胞呈碎片。 3、如果试管内液体变红而透明者，称完 全溶血（），镜检发现细胞全部呈碎 片。 【注意事项】 1、鸡血在离心时，试管均需在扭力天平上平衡。 2、离心结束后，小心倾去上层血浆及中层血小板等 成分，尽量控干。目测红细胞体积或置于带刻度的 离心管中，加入生理盐水配成30%的红细胞悬液； 3、试管中有红细胞和测试溶液时，不应摇晃，以免 人为造成红细胞破裂。 【作业】 1、书写实验报告，并就细胞膜对不同物质的渗 透性不同，对实验结果进行分析(
11、见表1)。 表1 各种溶液的溶血现象观察结果 编号测试溶液是否溶血分析原因 10.128mol/L NaCl 20.128mol/L NH4Cl 30.128mol/L NH4AC 40.128mol/L NaNO3 50.09mol/L Na2SO4 60.24mol/L 葡萄糖 70.24mol/L 甘油 80.24mol/L 乙醇 90.24mol/L 丙酮 100.128mol/L KNO3 11H2O 目测法判断标准：快速溶血：；慢速溶血：或；不溶血： 各种溶液的溶血现象观察结果 实验三、叶绿体的分离与观察 【实验目的】 1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一 般原理和方法
12、。 2、观察叶绿体以及气孔、表皮细胞、保卫细胞的形 态，加深对植物组织形态的了解 叶绿体 【实验原理】 将动植物组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差 速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离 心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状稠密度 ，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定 的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒 其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就 能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后 分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚 细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol/L 氯化钠或0.4 mol/L蔗糖溶液)中进行，以免 渗透压的改变使叶绿体受
13、到损伤。将匀浆液 在1000 rmin的条件下离心2 min，以去除 其中的组织残渣和一些末被破碎的完整细胞 。然后，在3000 rmin的条件下离心5 min ，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核) 。分离过程最好在0 5的条件下进行；如 果在室温下，要迅速分离和观察。 【实验材料】 1、主要设备：普通离心机、组织捣碎机、扭 力天平、光学显微镜。 2、小型器材：500m1烧杯2个，250m1量筒1 个，滴管10支，10m1刻度离心管20支，纱布 若干，载玻片和盖片各4片。 3、 0.35mol/L NaCl溶液。 4、 新鲜菠菜。 【操作方法】 A、游离叶绿体的制备与观察 1、 选取新鲜的嫩菠菜叶洗净擦干后去除叶梗及组脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。 2、 利用组织捣碎机低速(5000 rmin)匀浆35mm。 3、 将匀浆用200目尼龙网或6层纱布过滤，于500m1烧杯中。 4、 取滤液4m1在1000 rmin下离心2min。弃去沉淀。 5、 将上清液在3000 rmin下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体 (混有部分细胞核)。 6、 将沉淀用0.35molL NaC1溶液悬浮。 7、 取叶绿体悬液1滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光
