检测和判定克隆基因的方法

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1、基因工程基因工程原理纲要原理纲要 第一讲第一讲 基因工程概论属实基因工程概论属实 第二讲第二讲 基因工程的主要技术基因工程的主要技术 第三讲第三讲 基因工程的酶学基础基因工程的酶学基础 第四讲第四讲 基因克隆的载体与受体基因克隆的载体与受体 第五讲第五讲 目的基因的克隆与分离目的基因的克隆与分离 第六讲第六讲 克隆基因的检测与鉴定克隆基因的检测与鉴定 第七讲第七讲 克隆基因的表达与产物纯化克隆基因的表达与产物纯化 第八讲第八讲 基因表达的调控基因表达的调控 第六讲 克隆基因的检测与鉴定 载体表型选择法载体表型选择法 根据插入基因的表型选择根据插入基因的表型选择 DNADNA电泳检测法电泳检测法

2、 核酸杂交检测法核酸杂交检测法 免疫化学检测法免疫化学检测法 转译筛选法转译筛选法 一、抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。 第一节第一节 载体表型选择法载体表型选择法 1. 原理： pBR322pBR322 （1）四环素： （2）氨苄青霉素抗性基因： 2. pBR3222. pBR322抗菌素标记选择抗菌素标记选择 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（ 蓝灰色）褪色。 抑制细菌生长，但不杀

3、死细菌。 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。 （3）环丝氨酸： 3. 3. 选择过程：选择过程： 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素 抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平 板培养基选择重组克隆。 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨 酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而 被环丝氨酸杀死。 （1）四环素抗性插入失活 无环丝氨酸培养基 （2 2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素 抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。 二、二、 - -半乳糖苷酶显色反应选择法半乳糖苷酶显色

4、反应选择法 -半乳糖苷酶 乳糖 半乳糖葡萄糖 X-gal半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝 + + 深蓝色 1. 原理： 载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失） 。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以 互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。 假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密 码；（不破坏 肽）。 2. 2. 选择过程选择过程 -半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择 。（只在特定条件下）。 转化进来的外源基因产物能够弥

5、补受体菌 株的突变型缺陷。 一、原理： 第二节第二节 根据插入基因的表型选择根据插入基因的表型选择 1.弥补缺陷 his- his+ 受体菌： 外源基因： 在不含组氨酸的 培养基中生长 小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二 氨嘧啶有抗性。 DHFR 载体 连接 转化受 体菌 三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板 含DHFR的克隆才能生长 例： 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 2. 2. 增加新性状增加新性状 利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型 载体分子量大。 一、直接电泳检测法 从转化后的菌体克隆中 分离质粒，电泳、比较 其分子量。 第三节第三节 DNADNA电泳检测法电泳检测法

6、 分子量 Marker 载体 重组克隆 二、酶切电泳筛选法二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱， 选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳 结果（DNA带数和长度）。 或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶 切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的 结果。 A B A或B 不同克隆的酶切结果 筛选过程筛选过程 三、三、PCRPCR扩增检测法扩增检测法 1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程 （1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。

7、（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。 1. 核酸杂交 第四节第四节 核酸杂交检测法核酸杂交检测法 一、原理： 重组克隆与探针杂交。 3. 识别标记 32P 或 125I 。 （1）放射性同位素 2. 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 （2）非放射性标记 荧光素 二、核酸杂交检测方法二、核酸杂交检测方法 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 1. Southern blotting 从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体）， 再用探针杂交。 只有带有插入片断的重组载体才能与探 针杂交，在底片上曝光显示。 酶切前 酶切后 插入片断 载体 Southern Southern bl

8、ot blot 筛选筛选 结果结果 （1 1）原位杂交筛选）原位杂交筛选 特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以 直接找出阳性菌落。 （2 2）R-R-环检测法环检测法 DNA-RNA杂交。 1）原理： 2）选择过程 在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时 候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳 定。电镜下可见一种R-环形结构。 用外源基因的mRNA与重组载体杂交。 缺点：需要电镜！ 2. Northern blotting2. Northern blotting 用DNA（或RNA） 探针检测RNA样品 。 主要检测插入片断 是否被转录。 从宿主细胞中提取 RNA，再用探

9、针杂 交。 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表 达出相应的蛋白质的外源基因。 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性 质可分为几种作用方式： 一、放射性抗体检测法一、放射性抗体检测法 第五节第五节 免疫化学检测法免疫化学检测法 1. 抗体与产物的结合方式 对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交” 待测基因 产物蛋白 一抗二抗 125I 标记的二 抗结合蛋白 固相支 持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 125I标记的二抗 固相支 持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 固相支 持滤膜 固相支 持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗二抗 125I 标记的二抗 结合蛋白 125I标记的二抗 2. 2. 放射

10、性抗体检测法过程放射性抗体检测法过程 3. Broome-Gilbert3. Broome-Gilbert双位点检测法双位点检测法 质粒基因A 插入基因B 表达 质粒蛋白A外源蛋白B 融合蛋白 检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 固相支 持滤膜 抗A抗体 125I标记的 抗B抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 质粒蛋白A外源蛋白B固相支 持滤膜 抗A抗体 发光，底片曝光 二、免疫沉淀检测法二、免疫沉淀检测法 把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入 基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时， 就会与抗体反应形成“沉淀圈”。 1. 原理 抗原抗体凝集反应。 检测分泌型产物。 2. 方法

11、对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位 溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。 三、酶联免疫吸附测定（三、酶联免疫吸附测定（ELISAELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理： 一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底 物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定 有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子 的含量。 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 酶 待测基因 产物蛋

12、白 一抗二抗 无色的底物有色的产物 比色观察 酶 2. ELISA2. ELISA检测的一般步骤检测的一般步骤 （1）固定样品 将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。 孔底 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 （2 2）一抗结合）一抗结合 一抗 加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗 掉。二抗只识别一抗。 二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、 脲酶等）。 （3 3）二抗结合）二抗结合 二抗 加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应 转变成有色物质（或发光）。 （4 4）显色反应）显色反应 在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，

13、打印出结 果。 （5 5）比色）比色 3.ELISA3.ELISA的局限性的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性） 。 必须与其他方法一起综合考虑。 最好用单克隆抗体（monoclonal antibody） 临床检验常用的单抗 四、免疫印迹（四、免疫印迹（western blottingwestern blotting）法）法 1.原理： 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。 （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维 持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带 上负电荷。 SDS: （SDS-PAGE）： 聚丙烯酰胺凝胶电泳

14、（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）：）： （Polyacrylamide gel electrophoresis） 在电场的作用下线性蛋白 质链在聚丙烯酰胺凝胶介 质中向正极移动，移动的 速率主要取决于其分子量 大小（链的长短），从而 把不同分子量的肽链分开 。 电泳buffer 电泳buffer 点样 电泳方向 蛋白质电泳的分子蛋白质电泳的分子 量标准量标准 已知分子量的蛋白质混合 液，与待测样品一起电泳 ，为样品蛋白质提供分子 量估计。 商品化供应 Da 道尔顿(质量单位, 等于一 氧原子质量的十六分之一 。 一克约为61023道尔顿 Dalton SDS PAGE 凝胶中的蛋白质染

15、色：凝胶中的蛋白质染色： 考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可褪色 回收。 硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。 2）转到膜上进行染色。 1）直接染色 直接染色电泳结果 （2 2）Western blottingWestern blotting 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到 膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜 等）。 Western（转膜） 胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正 极一侧的膜上。 膜胶 蛋白 WesternWestern装置装置 BlottingBlotting 原理与ELISA相同。 待测蛋白 硝酸纤 维素膜 一抗 二抗 辣根过氧 化物酶 底物产物， 并发出光 PAGE胶待测蛋白 底片曝光 辣根过氧化物酶：HRPO 1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。 2）洗去未结合的一抗。 3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。 BlottingBlotting过程过程 Immuno Blotting 结果结果 多克隆抗体 Blotting的结果 单抗blotting结果 一、无细胞翻译系统 第六节第六节 转译筛选法转译筛选法 能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。 如：麦胚提取物系统、网