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1、RNA干扰在慢性疼痛治疗中的应用第二军医大学东方肝胆外科医院麻醉科 吴飞翔综述俞卫锋审校摘要 慢性疼痛的治疗临床上效果不佳，集中发展更多有效的治疗方法已经成为一个普遍的主题。RNA干扰就是一种有潜力的新方法，通过siRNA的输入可选择性降解疼痛相关蛋白的mRNA，从而解除疼痛。慢性疼痛通路中某些兴奋性异常增高的位点因而成为siRNA的沉默目标。本综述将主要就siRNA的干预靶位及其临床应用的难度进行阐述。关键词慢性疼痛siRNARNAiP2X3受体 简介慢性疼痛不仅是医学界的一个难题，而且已成为社会经济的一大负担，据统计，全世界有三亿二千多万人受到慢性疼痛的困扰。慢性疼痛大致分为以下几种：术后
2、疼痛、癌性疼痛、下腰痛、HIV痛、神经病理性疼痛、关节痛和偏头痛。目前慢性疼痛的治疗效果不佳，特别是晚期癌痛和慢性顽固性疼痛。静脉或口服阿片类药物是缓解疼痛的最佳方法，但又带来呼吸抑制、便秘及成瘾等诸多副作用，病人自控镇痛技术的出现，给癌痛患者带来了福音，但同样存在难以长期维持、增加感染机会、费用较高等问题。寻找更方便、有效、且经济、安全的镇痛方法，成为人们关注的课题。最近，RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术在慢性疼痛模型研究中取得一定进展，表明它有望成为一种具有潜力的疼痛治疗的新方法。RNA干扰及其作用机制所谓RNA干扰RNAi就是利用双链RNA(double s
3、tranded RNA, dsRNA)高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA 降解,使细胞表现出特定基因缺失表型的过程，即诱导序列特异的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS) 1 。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是由双链RNA诱导的，其作用机制起始阶段和效应阶段(initiation and effector steps) 2 。在起始阶段，外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA 将被RNase 家族中的一个能够特异性识别双链RNA的酶Dicer，以ATP依赖的方式逐步切割为212
4、3nt的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNA) 3 。siRNA 3末端有23个游离末配对的核苷酸(dTdT或UU)。在效应阶段，siRNA双链与核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing complex, RISC)。RISC以ATP依赖性方式激活，RISC中siRNA变性，双链解开，卸下正义链，反义链仍结合在复合物上，并引导RISC与同源的靶目标RNA结合，在核酸内切酶的作用下，自距离siRNA 3端12个碱基的位置处将靶mRNA切断，从而阻断了基因表达 2 。siRNA还可以作为一种特殊的引物，在RN
5、A依赖的RNA 聚合酶（RdRP）的作用下，以靶mRNA为模板合成dsRNA分子，后者又可被RISC降解为新的siRNA，新生成的siRNA又进入上述循环，这一过程被称为随机降解性聚合酶链反应( random degradative PCR) 2 。新生的dsRNA反复合成与降解，不断形成新的siRNA，从而使靶mRNA不断减少，导致目的基因沉默，呈现RNAi现象。RdRP一般只对所表达的靶mRNA发挥特异性扩增作用，每个细胞仅需少量dsRNA即有可能完全抑制相应基因表达 4,5 。 慢性疼痛的病理生理学慢性疼痛时，外周和中枢的疼痛感觉传导机制有很多改变，以致疼痛在损伤愈合后仍持续存在。慢性疼
6、痛通常分为伤害感受性疼痛(即术后疼痛和关节疼痛等)和神经病理性疼痛(如神经病变相关性疼痛)。癌性疼痛和HIV相关性疼痛同时存在伤害感受性疼痛和神经病理性疼痛 6。慢性疼痛的特点为“周围敏化”，即C纤维激活的阈值降低，对轻伤害性刺激的反应强化和延长(痛觉过敏)。周围敏化可由神经或组织损伤后细胞释放的介质引起。外周机制使初级传入神经异常激活增多，从而增加了向脊髓传导的信号流，最终导致兴奋性的改变而引起“中枢敏化”的现象。中枢敏化是二级神经元(位于脊髓深层和大脑)综合反应的改变，也通常被认为是“超敏”(对非伤害性刺激表现出疼痛反应)的基础 7 。慢性疼痛的其它中枢机制包括脊髓背角抑制性神经元的脱抑制
7、、疼痛通路易化和下行抑制的改变。外周与中枢机制在外周与中枢神经系统神经元和非神经元细胞中都存在着基因和蛋白表达的改变和/或蛋白翻译后修饰的变化，这种变化是慢性疼痛表现型不同的原因。siRNA的干预靶位虽然伤害性通路非常复杂，疼痛的机理不甚明了，增高神经兴奋性的基因也很多，但是沉默某些关键的基因仍有望在顽固性疼痛治疗中起效。siRNA用于疼痛治疗还处于探索阶段，关于siRNA介导的下调疼痛基因方面的文献较少，但反义寡核苷酸（ASOs）对疼痛基因下调和某些药物拮抗剂对疼痛靶位拮抗的例子可以给我们提示，哪些靶位可能用于siRNA沉默。1、外周位点初级传入神经外周末稍受体或离子通道的选择性下调会导致炎
8、症介质(ATP、缓激肽、氢离子、神经生长因子、前列腺素)的激活减少。最近已有siRNA介导基因沉默的实例，用21个核苷酸siRNA与ATP门控阳离子通道P2X3完全互补来靶向P2X3受体，用错义siRNA和空白作对照，经腰椎留置管注射于小鼠鞘内，结果发现，与对照组相比，P2X3 siRNA处理组大鼠后爪注射P2X3受体激动剂-亚甲基ATP引起的机械性痛觉过敏和触觉超敏明显减轻。在分子水平，DRG中的P2X3受体mRNA和背角初级传入末稍中的P2X3受体蛋白也都大大减少。大鼠部分坐骨神经结扎模型中，P2X3 siRNA注射两天后，机械性痛觉过敏和触觉超敏都逆转50%，且效果持续存在 8,9 。此
9、实验开辟了一条用siRNA作为遗传工具治疗慢性疼痛的新道路。辣椒素受体VR1是为一种非选择性的阳离子通道， 在炎症诱导的热敏感反应中起重要作用。VR1基因敲除的小鼠对辣椒素几乎没有细胞内的或行为上的反应并对有害性热引起的反应大大减轻。在siRNA靶向VR1 mRNA的比较研究中发现，siRNA是最有效的AS（antisense）分子，其效应是AS寡核苷酸的100倍。单次小剂量鞘内注射siRNA可有效减轻单根神经病变的大鼠的冷超敏，但是当反复鞘内注射siRNA时，发现有较强的副作用 10 。控制动作电位形成(如电压门控钠离子通道)的基因也是干预的潜在靶位 11 。鞘内输入ASO后使编码Nav1.
10、8的mRNA下调，从而引起通道蛋白水平下降50%，有效地逆转单根神经病变(L5/L6脊神经节损伤)大鼠的温度和机械性痛觉过敏 12 。另一研究表明在L5和L6神经节广泛变性后，Nav1.8蛋白在L4坐骨神经未损伤的无髓鞘及一些有髓鞘纤维重新分布 13 ，Gold等认为，在神经病理性疼痛模型中，Nav1.8在这些完整未受损的纤维表达可使感觉传入异常放大，而利用反义核苷酸介导Nav1.8 mRNA降解可减弱此效应。损伤介导的Nav1.3通道与初级传入神经异位放电(神经病理性疼痛的特点)息息相关，靶向此通道也将显著减少外周神经的电活动 11 。2、脊髓位点伤害性通路的另外一个干预靶位可能是背角初级传
11、入神经突触前末稍的离子通道和受体，如与CNS内去极化诱导的神经递质释放相关的电压门控钙通道。在神经病理性疼痛和术后疼痛的临床实验和动物模型中，鞘内注射ziconotide (选择性N型钙通道阻滞剂)发现，在此位点抑制N型钙通道能缓解慢性疼痛 14 。 N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体主要位于脊髓背角浅层，在伤害性通路的易化上起着重要作用，可增强二级神经元的敏感性和活性。最近，Tan等用siRNA靶向NMDA受体亚单位NR2B，经鞘内注射后发现NR2B mRNA及其相关蛋白含量明显降低，福尔马林诱导的大鼠疼痛反应明显减轻 15 ，说明在此位点上运用siRNA治疗慢性疼痛具有一定的有效性和可
12、行性。实验表明，除外周作用外，Nav1.3通道在脊髓损伤大鼠模型的背角二级神经元中亦上调。Nav1.3通道是背角神经元兴奋性增高的原因，与机械性超敏和温度性痛觉过敏相关 16 。鞘内注射ASO直接靶向Nav1.3通道可降低背角神经元兴奋性，降低神经病理性疼痛反应。因此不论在外周还是在脊髓水平，此通道都可能成为siRNA的候选靶位。G蛋白是阿片类受体介导的疼痛信号的重要媒介。长期或短期运用阿片类药物可通过阿片类受体激活细胞外信号信号调节激酶（Extracellular signal-regulated kinases，ERK），产生药物依赖、耐受和成瘾等效应。而Goa亚单位与细胞外信号调节激酶的
13、活性相关。Zhang等利用siRNA靶向Goa的mRNA，明显阻滞这一信号通道 17 ，因而可用于减轻阿片类药物的耐受，有助于疼痛的长期治疗。在脊髓中，某些在非神经元细胞中表达的、与高敏感性相关的基因也可能是siRNA作用靶点。小胶质细胞分泌的信号分子：如细胞因子、TNF-和NO，都是慢性疼痛的神经炎症反应的成员 18 。最近，Tsuda 19 等用ATP激活后将小胶质细胞注入大鼠脊髓，引出超敏反应，证实小胶质细胞参与了神经病理性疼痛。小胶质细胞只表达两种嘌呤能受体：P2X4和P2X7，在神经病理性疼痛大鼠模型中，寡核苷酸介导的P2X4 mRNA降解可阻止小胶质细胞活化，从而降低触觉超敏，也充
14、分证实了这一点 19 。3、脊髓以上位点siRNA的另外一些靶位有可能存在于脊髓以上的脑内，但还没有用基因沉默方法加以探究。siRNA在人体此位点的有效应用从治疗上来说，吸引力较小，而且还存在技术上的挑战。利用表面含有单克隆抗体的免疫性脂质体包被shRNA表达质粒，经静脉注射，通过单克隆抗体同转铁蛋白的特异性结合可介导质粒通过血脑屏障，沉默脑内的靶基因 20 。这一投放系统可使RNAi借助静脉注射的质粒DNA作用于CNS的疼痛相关靶位。siRNA应用于疼痛治疗的评价传统的反义核苷酸技术效果较差，而siRNA则克服这一缺点，沉默基因效果为其数十倍 10 ，具有高效、特异的特点，但是要最终应用于人
15、体仍面临很多困难。1、siRNA用于疼痛治疗的优点用siRNA来沉默基因的一个主要优点是适用于“蛋白质蛋白质”的相互作用。这种大分子之间的相互作用难以用低分子量的小分子物质阻断，而siRNA则可通过转录后机制加以抑制。最近报道了一个很典型的例子。胞浆蛋白arrestin同磷酸化形式阿片类受体、未偶联G蛋白的阿片类受体结合可导致受体降解。用低分子量的抑制剂阻断阿片类受体同-arrestin间的作用一直是一个挑战，用反义链介导的-arrestin信号的降解就成功解决了这一难题。-arrestin基因已在坐骨神经结扎的大鼠中被ASO下调，并使鞘内注射吗啡的耐受效应延迟 21 。siRNA的另一优点是
16、特异性强，沉默对象可以是具有相似序列和分子结构的异构体。如电压门控的钠通道，很难获得小分子的抑制剂。通过慎重选择siRNA的反义序列，可选择性抑制这些相似结构的靶位点而不影响其它的异构体。还有，某些基因具有多个不同的剪接位点，可以利用siRNA沉默特异的外显子而不影响其它的外显子。2、siRNA临床应用的主要障碍siRNA用于治疗的一大障碍是siRNA的稳定性。在缺乏大体积的siRNA容量或缺乏脂质体的情况下siRNA在血清内的降解实际上是极快的。因此要选择合适的寡核苷酸的化学形式或用这表明或者用其它方法对分子进行保护，防止被核酸酶降解。可将siRNA鞘内注射，核酸酶的活性在CNS大大降低，用标准的siRNA 单链，3端有两个脱氧胸腺嘧啶脱氧核苷（dT
