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1、分子生物学实验技术总体设计 时间：周二 8：3010:00 地点：309室 内容：讲授： 1.重组DNA的实验方案 2.相关概念 3.目的基因的获得cDNA mRNA 提取、PCR(酶切位点） 实验：上午 1.mRNA 提取 2. PCR 下午 3. 电泳(分组操作） 时间：周三 地点：309室 实验：上午 1.PCR产物纯化回收（分组操作） 2.酶切（分组操作） 3.电泳 4.切胶回收 下午 1.连接 2.转化（分组操作） 时间：周四 地点：309室 实验：下午：质粒提取（分组操作） 酶切电泳（略） 主要知识点：基因重组的概念及过程； 用于重组DNA技术的理想载体应该具备 的特点；获得目的基
2、因的途径；真核表 达体系的优点；常用真核细胞转染方法 的种类；RT-PCR的基本实验步骤（包括 PCR）；限制性内切酶的特点 重组DNA技术 Recombinant DNA Technology 重组重组DNADNA技术相关概念技术相关概念 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或 拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning) ， 即无性繁殖。 DNA克隆 技术水平： 分子克隆(molecular clone)即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物） DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA）与
3、载体DNA接合成一具有自我 复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而 通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因 的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一 DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 基因工程(genetic engineering) 实现基 因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程， 又称重组DNA工艺学。 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒噬菌体病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNAcDNA 人工合成PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA目的基因
4、连接酶 重组体 转化体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交 目 录 鉴定（测序） 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 目 录 载 体 定义： 能够携带外源基因并且具有自主复制能力的 DNA,是将目的DNA导入受体细胞的工具。 在重组DNA技术中，常用基因载体有两种类型： 克隆载体 表达载体 载体的特点 具有自主复制能力，保证重组DNA分子可以在宿主细胞 内得到扩增； 具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开， 便于分离提纯； 具有一个或多个筛选标记（如对抗生素的抗性、营养缺 陷型或显色表型反应等），便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外
5、源DNA插入点），常具有多个单一酶切 位点，称为多克隆位点，便于目的基因的克隆； 分子量相对较小，易于操作，以容纳较大的外源DNA； 具有较高的遗传稳定性； 使用安全。 载体种类 1. 质粒(plasmid) 2. 噬菌体(phage) 3. 柯斯质粒/粘粒 （cosmid） 4. 人工染色体： 细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome,BAC） 酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome,YAC） 哺乳动物人工染色体（mammalian artificial chromosome,MAC） 5. 动物病毒DNA改造的载体
6、（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） 质粒 (plasmid) 特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗 传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 细菌中独立于 染色体外的双链 闭环DNA分子。 目的基因的获取 1. 化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其 产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 5.从已有重组载体中获得 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复
7、制 * 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 碱水解 T T T T 目 录 聚 合 酶 链 反 应 Polymerase Chain Reaction 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与 模板5末端和3 末端相互补的寡核苷酸片段为引物 ，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制 沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一 过程，即可使目的DNA片段得到扩增。这一过程成 为PCR。 n 模板DNA n 特异性引物 n 耐热DNA聚合酶（Taq 酶） n dNTPs n Mg2+ PCR体系基本组成成分 PCR的基
8、本反应步骤 1.变性：将反应系统加热至95 ，使模板DNA 完全变性成为单链； 2.退火：将温度下降至50左右，使引物与模板 DNA退火结合； 3. 延伸：将温度升至72 ，DNA聚合酶以dNTPs 为底物催化DNA的合成反应。 上述三个步骤为一个循环，经2530次循环后 ，可将模板DNA扩增达百万倍。 PCR的基本反应步骤 变性 95C 延伸 72C 退火 50C 5 Primer 1 5 Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5 5 5 5 5 5 Template DNA 5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理 目 录 Cycle 3 5 5 5 5 5 5 5 5
9、 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。 目 录 Cycle 3 重组DNA技术的基本过程及技术路 线 分-获取目的基因 切-限制性内切酶 接-连接目的基因及载体 转-重组子转入宿主细胞 筛-筛选出含有重组子的宿主细胞 mRNA 提取 cDNA PCR 琼脂糖电泳 RT-PCR 凝胶中回收PCR产物 目的DNA与载体双酶切 DNA与载体的连接 转化 质粒的提取 酶切鉴定 测 序 表 达 以构建pBSK-Akt1-WT重组体为例 一、PCR扩增得到Akt1/PKB的cDNA 设计基因特异性引物a、b，以克隆在质粒 pCIS2-Akt1上的A
10、kt/PKB cDNA为模板5 端引入 Hind酶切位点，3引入BamHI酶切位点，以 a、b为引物，扩增野生型Akt1/ PKB。 引物a(划线部分为Hind酶切位点)： 5- GCGAAGCTTCCATGAACGACGTAGC CATTGT-3 引物b(划线部分为BamHI 酶切位点)： 5- ATTGGATCCTCAGGCTGTGCCACTGG CTGAG-3 PCR产物末端限制酶切位点的切断情况 10PCR反应缓冲液 5.0 l dNTP mix(2mmol/L) 4.0 l Ex Taq DNA聚合酶(5U/l ) 0.25 l 引物 a (10pmol/l ) 2.0 l 引物 b
11、 (10pmol/l ) 2.0 l pCIS2-Akt1 5ng 加水至 50 l 应用TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶， 反应体系为50 l 94预变性1min，然后按照94 30sec，63 45sec， 72 1min，进行29个循环，最后72延伸10min 。 电泳检测 PCR结果 PCR产物的回收和鉴定 将上述PCR产物全部电泳，然后按照TaKaRa DNA凝胶回收试剂盒的说明书回收PCR产物。 电泳检测回收的PCR产物 二、PCR产物和表达载体的限制性内切酶酶切 1、酶切体系的组成及注意事项 内切酶：根据实验的目的选择限制性内切酶。对于基因克 隆，选择粘性末端可提高连接效
12、率。 DNA：DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含有过量 的酚、氯仿、乙醚、大于10mmol/L的EDTA、SDS以及过 量的盐离子浓度，以免影响限制性内切酶的活性。 反应缓冲液：每一种限制酶都有其一系列最佳反应条件， 甚至来源于不同厂家的同一种限制酶的反应缓冲液也不尽 相同，应该严格遵照产品说明书进行操作。 2、限制酶操作时应注意的原则： 限制性内切酶从冰箱中取出后，应置于冰中。一般总是在其 它试剂加完后，再加入内切酶。 必须使用新的灭菌吸管，1个吸管不能反复使用，更不可交 叉使用。 内切酶的容积不能超过反应总容积的10，否则使甘油终浓 度达到5将会抑制酶在该体系中的活性。 酶应分装成小
13、份。当切割大量DNA时，通常用延长反应时间 来减少酶的用量。 同一种内切酶消化多个DNA样品时，应计算所需酶的总量， 再将酶稀释液分配到各个反应管中，以减少酶液储存管的污 染机会。 PCR产物(或pBluescript II/SK) 12l 10Y+/Tanqo（with BSA） 2l Hind(10U/ l ) 1.5l BamHI (10U/l ) 1.5l 补水至 20l 三、PCR产物与载体的连接 建立连接反应时注意： 1、温度。粘性末端的连接一般在16进行，以保证粘性末端 退火及酶活性、反应速率之间的平衡。 2、酶量。 3、DNA量。载体与目的DNA的分子数比例一般为1:3。 四、重组体导入受体细胞 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) 在重组DNA技术中 转化：将质粒DNA或以它为载体构建的重 组子导入细菌的过程。 转染：病毒及其重组子导入真核受体细胞 转导：噬菌体及其重组子导入受体细胞 真核细胞转染的方法 脂质体法 磷酸钙法 电穿孔法 DEAE葡
