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1、刘颖 组织学与胚胎学教研室 (in situ hybridization histochemistry) 变性 变性温度（Tm） 复性 共价键 酯键 James Watson and Francis Crick (Cambridge) discover the structure of DNA. DNA变性(denaturation) 指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。 变性温度（melting temperature,Tm） 热变性使DNA分子双链解开所需温度称为熔解温度。 影响Tm的因素 DNA的均一性 DNA分子中的（G+C）含量 溶剂的性质 p低离子强度，Tm低
2、 高pH 变性剂甲酰胺 复性（renaturation） 指变性的DNA(单链)在适当的条件下，两条彼此分开的多核苷 酸链又可以重新结合成双螺旋 结构 复性的影响因素 温度 DNA浓度 DNA片段长度 DNA分子的复杂性 离子强度 两条互补DNA或RNA单链之间以复性的原 理形成双链核酸的过程 o 影响杂交体稳定性的因素 n 杂交双链的碱基组成 n 杂交双链的长度 n 碱基错配程度 n 离子强度 n 变性剂浓度 核酸分子杂交 液相杂交 固相杂交 p应用特定标记的已知核酸探针与组织或细胞中待测 的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂 交体，杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观察 。 p可进
3、行细胞内核酸定性、 定位的一种技术。 定义：一种带有标记物的、已知的、仅 与靶分子特异反应的分子。 探针的种类 DNA探针 cRNA探针 寡核苷酸探针 DNA探针 基因组DNA探针 最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链 DNA或 单链DNA探针 cDNA探针 互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的 优点：制备方法简便，不易降解，标记方法较成熟 cRNA探针 以cDNA为模板在体外转录而成的探针 优点 p单链探针，故以cRNA探针进行杂交反应可避免应用双 链cDNA探针作杂交反应时存在的两条链之间的复性问 题。 pcRNA和mRNA之间形成的杂交体要比cDNA-mRNA
4、杂交体稳定因此杂交反应后可经受高严格度洗涤。 pcRNA-mRNA杂交体不受RNA酶的影响，故杂交后还 可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。 缺点 p制备过程较复杂，需要较高的分子生物学实验条件， pcRNA对RNA酶敏感，易被RNA酶破坏，因而在操作 过程中需严格防止RNA酶污染。 寡核苷酸探针 根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核 苷酸片段。 优点： 短的探针比长探针杂交速度快，易穿透组织。 制备简易，可以在短时间内大量制备，序列任定。 在合成中进行标记制成探针。 使用简便，可合成单链探针，避免了用双链DNA探针 在杂交中自我复性，提高杂交效率。 寡核苷酸探针可以检测小
5、DNA片段，在严格的杂交条 件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。 探针的标记 探针标记物 放射性同位素 3H 、35S或32P 易掺入，敏感，易检测， 时间长，污染 非放射性标记物 稳定，分辨率高，时间短，操作简便 ，无污染 酶类：HRP,AKP 半抗原：生物素,地高辛，2，4-二硝基苯（DNP） 荧光素：FITC,罗丹明 探针标记方法 根据探针的标记物 是否能直接检测 直接法 间接法 标本制备 杂交前处理 杂交反应 杂交后处理 检测杂交信号 取材 固定 固定剂 4PFA 固定方法 切片 石蜡切片 冰冻切片 培养细胞 增强组织通透性和核酸探针穿透性 去污剂处理 Triton X-100处理
6、15min 蛋白酶处理 蛋白酶K ，37孵育1530 min 减低背景染色 酸酐和稀酸处理 0.25%乙酸酐处理10 min 预杂交 不含探针的预杂交液在杂交温度下预先孵育标本12h 内源性生物素和酶的抑制 用5%脱脂奶粉缓冲盐液来稀释标记的卵白素以及将标本浸于含2%牛血 清白蛋白的缓冲液 对于内源性的AKP和过氧化物酶可通过将标本分别浸于20%乙酸(4) 中15秒或过碘酸淋洗和用含1%H2O2的蒸馏水或甲醇溶液室温孵育 30min加以阻断。 双链DNA探针和靶DNA变性 杂交反应进行时，探针和靶核酸必须是单链。 杂交液 探针 探针长度 50-100bp，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入
7、细胞， 杂交率高，杂交时间短。 探针浓度 0.5-5.0g/ml 。 甲酰胺可使Tm降低，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破 坏以及标本的脱落。 硫酸葡聚糖能与水结合，提高探针有效浓度。 牛血清白蛋白阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背 景。 杂交温度和时间 大约在3060之间。一般将杂交时间定为1620h，或为了方便，将杂 交液和标本孵育过夜 用杂交液孵育组织切片，杂交液中标记的核酸探针在适当的条 件下与组织细胞内相应的靶核酸互补结合形成杂交体的过程。 杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度 盐溶液的漂洗 一般而言，盐浓度由高到低，而温度由低到高 ，漂洗1015mi
8、n。高浓度的盐可减少探针与 组织标本间的静电结合。 漂洗过程中，还必须注意防止切片干燥，因干 燥的切片即使用大量溶液漂洗也很难减少非特 异性结合。 放射性同位素标记探针的检测 32P、125I、35S等放射性同位 素均可用来标记探针，利用 感光乳胶记录被研究材料中 放射性物质分布和定位。 非放射性标记探针的检测 常用非放射性标记物多为半 抗原，以半抗原标记探针的 原位杂交信号可通过免疫酶 组织化学或亲合组织化学技 术显示。 是通过一定的方法使杂交反应形成的杂交体成为 在显微镜下可识别的产物。 放射性同位素标记 探针的检测 非放射性标记探针的检测 组织对照 Southern/Northern 免
9、疫组织化学 探针对照 已知阳性组织和已知阴性组织 用有意义链RNA探针 吸收试验 杂交反应对照 空白实验 杂交前用核酸酶预处理标本 检测系统对照 放射自显影检测系统对照 非放射性原位杂交检测系统对照 原位PCR技术 荧光原位杂交技术 胚胎原位杂交技术 双重和多重原位杂交技术 原位杂交结合免疫组织化学技术 电镜原位杂交技术 肽核酸原位杂交 p将PCR技术与原位杂交技术结合起来，不改变 周围组织的原有位置，直接在组织、细胞或病 原体原位研究基因变化的技术。 p根据在扩增反应中所用的dNTP或引物是否 标记，原位PCR可分为： n直接法原位PCR n间接法原位PCR 直接法原位PCR 在标本进行PC
10、R扩增时，标记物掺入到扩增产物中，无需分子 杂交。 优点:操作简便、省时. 缺点:特异性较差、扩增效率较低、易出现假阳性，特别是在组 织切片上，假阳性信号主要来自标本中受损DNA的修复过程 。 固定组织蛋白酶K消化 PCR扩增 显微镜观察 dNTP-荧光素 或dNTP-地高辛 -生物素 或荧光染料抗地高辛抗体 抗生物素抗体 间接法原位PCR 先将引物、核苷酸及酶等反应物引入细胞内进行扩增，然后用特异性 标记探针与扩增产物进行原位杂交，检测细胞内扩增的DNA产物。 优点:克服由于DNA修复或引物错配引起的非特异性染色问题，使扩 增效率提高，特异性增强. 缺点:操作步骤繁琐，用时长。 固定组织蛋白
11、酶K消化 PCR扩增 显微镜观察 原位杂交 原位逆转录PCR 原理:是将逆转录反应和PCR相结合，在原位检测细胞 内低拷贝mRNA的方法。 分类:直接法和间接法. 步骤:1.用DNA酶处理以破坏组织细胞中的DNA。 2.逆转录 3.扩增 优点：不需从标本中提取mRNA,不会因在核酸的 分离中造成靶序列破坏而致信号丢失。 原理:一种利用荧光信号对原位杂交样本 进 行检测的技术。 直接FISH 间接FISH 将已知碱基序列的特异DNA片断作为探针，并标记上不 同荧光素，在组织切片、染色体标本上与靶核酸进行 DNA-DNA原位杂交，因所形成的杂交体带有荧光素，故 可在荧光显微镜下直接观察. 常用的荧
12、光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、得克萨斯红 (Texas Red)、罗丹明(rhodamin) 等。 简单、快速 信号较弱，敏感性较低。 使用非荧光标记的探针，如生物素或地高辛等 标记探针，再通过亲和连接或免疫反应带入各 种发光物质来检测杂交体的存在。 因为有杂交信号放大作用，从而增加了杂交的 敏感性，也降低了实验成本，故间接法FISH 是目前使用较多的方法。 地高辛or生物素 通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针 结合(直接法)，在一个细胞核中可呈现多种颜色标记，同 时检测多种染色体异常。 Figure 1. Upright optical slice of an intact
13、 embryo in blastoderm stage. Double staining for mRNA and protein. Target mRNAs for in situ probes (sog and sna) and protein stained by primary antibody (anti-Dorsal) are indicated in the figure. DAPI was used to label the nuclei. Note that the expression of sog and sna are located apically in the c
14、ytoplasm, while the expression of Dorsal is nuclear. 十二色荧光原位杂交技术鉴定食管癌KYSE450细胞系核型 各染色体标记的探针池组合 将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA 纤维，然后用标记不同颜色荧光物质的探针与DNA纤维进 行杂交，最后用荧光显微镜观察结果并分析. 全胚胎原位杂交 从整体水平反映胚胎发育过 程中基因表达的时空顺序, 是 一种广泛应用于胚胎发育调 控基因表达研究的技术。 胚胎组织切片原位杂交 A：小鼠10.5 dpc胚胎ER反义RNA探针的杂交： RE(菱脑), MA(颌弓), PC(心包), SNT(脊
15、神经管), GR(生殖脊), LB(肢芽); B：小鼠10.5 dpc胚胎ERb 有意义链RNA探针的杂交; C: 13.5 dpc胚胎ERb 反义RNA探针的杂交结 果:TE(端脑), ME(中脑), MO(延髓), SC(脊髓), LB(肢芽)： D：小鼠13.5 dpc胚胎ERb 有意义链RNA探针的杂交 。 原位杂交结合免疫组织化学 肽核酸是一类人工合成的电 中性的肽链, 以多聚酰胺键形 成的类似核苷酸的物质。 具有一个拟肽骨架，没有磷 酸戊糖骨架. PNA链更容易和带有负电荷 的互补序列的DNA或RNA链 结合. PNA对互补DNA的错配容忍 程度比相应的DNA/DNA更低 . PNA不被目前已知的任何核 酸酶或蛋白酶所降解。 是一种核酸类似物，和普 通核酸分子区别在于在其 碳环的2氧原子和4碳原 子位置引入亚甲基桥形成 锁状结构，因此也称锁核 酸。 探针中每融合一个LNA能 够使Tm值升高2-10度 LNA的优势 增强热稳定性、杂交的 特异性、提高探针TM
