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1、实验二 DNA聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction (PCR) PCR技术的形成及发展 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司 人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有 划时代意义的聚合酶链反应。其原理类 似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条 件摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA 聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、 复性及延伸的温度与时间 PCR的改进与完善 Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是： Klenow酶不耐高温， 90会变性失活，每 次循环都要
2、重新加。引物链延伸反应在37 下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配 ，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段 不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽 较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由 于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性 时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成 一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了 不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能 引起生物医学界的足够重视 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热 杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热 DNA聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温， 在70下反应2h后其残留活性大于原
3、来的90% ，在93下反应2h后其残留活性是原来的60% ，在95下反应2h后其残留活性是原来的40% 。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增 反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异 性和扩增效率，增加了扩增长度 (2.0Kb)。由 于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性 也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片 段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的 被应用 PCR 技术的实验原理 模拟细胞内DNA合成的过程 利用了DNA变性、复性和能进行杂交的 特点 通过全自动的热循环仪来完成 PCR的基本原理 PCR反应条件
4、PCR过程 PCR的特点 12345 22 55 72 94 时间（min） 温度 （） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复13步 2530轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA变性 形成2条单链 模板DNA 95 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 9550 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50 引物1 引物2 DNA引物 72 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72 第1轮结束 95 第
5、2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 955072 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增 PCR反应的基本条件 模板的制备 模板是进行DNA体外扩增的依据，它的来源于不同 的材料。PCR对模板的质量要求很高，但对它量的要求 不高。 制备模板的材料： 新鲜材料：人或动物的血液及组织中提取； 从少量材料：痰、尿液、腹腔液等; 法医学的材料：血斑、精斑等； 考
6、古材料 从以往保存的材料，如石蜡切片的蜡块中。 提取的原理和方法：（略） 引物的设计： 设计引物应遵循以下原则： 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右 。 引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定 条件下可扩增长至10kb的片段。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜， G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非 特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以 上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条 引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成 引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物-3端的碱基，特别是最末及倒数第 二个碱基，应严格要求配对，以避免因
7、末端 碱基不配对而导致PCR失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点， 被 扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对 酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据 库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条 引物的浓度0.11umol或10100pmol，以 最低引物 量产生所需要的结果为好，引物 浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可 增加引物之间形成二聚体的机会。 PCR所用试剂： DNA聚合酶 buffer:包括两种，一种是含Mg+，一 种是不含Mg+ 。 dNTPs PCR的操作过程 设定一个加样配方： 标准的PCR反应体系： 10扩增缓冲液 5ul 4种dNTP混合物
8、 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 50ul 加样： 单样本加样 多样本加样 加样的顺序 PCR反应条件的设定： 预就性温度： 94，30秒 变性温度： 94，30秒 退火温度： 需要摸条件 延伸温度： 72，30秒 总延伸温度： 72，10分 PCR结果的鉴定 通过凝胶电泳的方式来进行。 PCR技术的应用 PCR的初衷是为特异性的扩增某段DNA 现在PCR在医学研究中主要是用于基因诊断， 常用于： 对遗传病的突变基因进行诊断 对病原体的基因诊断 通过PCR结合限制酶切的诊断
9、 SSCP技术进行点突变的诊断 RT-PCR进行结构基因的扩增及定量表达 荧光定量PCR技术 核酸的凝胶电泳 一、基本原理 1.核酸分子在水溶液中呈多聚阴离子。加上 电场，它们会向正电极的方向迁移。 2.在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速 度取决于核酸分子本身的大小和构型。分子 量大的DNA迁移速度慢。当分子量相同时， 超螺旋的DNA分子因其密度大，迁移速度快 ，松弛型开环DNA迁移速度慢于前者，而线 性DNA的速度最慢。 3电泳环境的影响：缓冲液的组成和离子强 度直接影响迁移速度。 当电泳缓冲液中无离子时，溶液导电性极小 ，电泳速度慢。 当电泳缓冲液中离子浓度极强时，则导电性极 高，并易
10、产热。 pH值也影响迁移率，溶液的pH远离样品的等 电点时，样品颗粒的电离程度大，相应的电泳 速率就大。 凝胶材料的不同，以及浓度的不同对同样大小 颗粒的电泳速率也不相同，因此，不同浓度的 凝胶分辨DNA分子大小的能力也不同。 表：琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 凝胶类型及结构 分离DNA片段的大小范围(bp) 0.3%琼脂糖 50 000-1 000 0.7%琼脂糖 20 000-1 000 1.4%琼脂糖 6 000-300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000-100 10.0%聚丙烯酰胺 500 -25 20.0%聚丙烯酰 50 -1 凝胶的作用 4凝胶电泳的目的： 可将大小不等
11、的DNA片段和蛋白分子 进行分离，并通过标准分子量maker鉴定 其大小。 对所要的目的分子进行纯化提取。 二、琼脂糖凝胶电泳 Agarose Gel Electrophoresis 琼脂糖是从海藻中提取出的长链状多聚糖 ，当它被加热到90时可被溶解成半透明 的液体，这时便于浇板并在冷却后固化成 凝胶。其凝固点这40-45。 琼脂糖电泳的优点：操作方便，并可用来 鉴定和纯化特定的DNA分子。 Agarose Gel Electrophoresis - + 3 Sample Well 25 ng 1 kb ladder 0.8% Agarose 1 2 4 6 8 10 12 kb Agaros
12、e Gel Electrophoresis Sybergold Detection Limit: 0.2-0.5 ng DNA EtBr Detection Limit: 5-10 ng DNA (Not in handout) 用低溶点琼脂糖来分离并纯化DNA。 琼脂糖电泳的不足之处：它的分辨范围在 0.3-50kb之间， 对一些分辨更小DNA分子 的实验将无法进行。 琼脂糖电泳结果的显示： 1.利用核酸与溴化乙锭吸附性强的特点 ，用溴化乙锭来显色。 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 基本原理：PAGE是以丙烯酰胺单体与N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（二者按一定比例混合成 母液，简称AA母液）在化学催化剂存在的条 件下凝聚而成的胶体。促凝的催化剂为过硫 酸胺（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）。 PAGE的优 缺点：优点是 分辨率高，理 论上可以讲， PAGE可以将 1bp的片段分 辨出来。缺点 是这种方法操 作复杂、耗时 间、成本高。 + 实验三 质粒DNA提取
