食品卫生微生物指标检测工作新

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1、河南工业大学 生物工程学院生物工程系 曾实 第三章 食品卫生微生物指标的检测 * 根据食品卫生要求,食品中需要检测的微生物 种类、数量及其代谢产物的种类和数量称为食品 卫生微生物学指标，是评判食品卫生质量的重要 依据。 1、什么叫食品卫生微生物学指标? 2、食品卫生微生物学指标的种类： 菌落总数；大肠菌群数；致病菌； 霉菌及其毒素；其他指标。 我国卫生部颁布的食品卫生微生物学指标 主要有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。 指食品检样经过处理， 在一定条件下（如需 氧情况、营养条件、 pH、培养温度和时间 等）培养后，单位重量(g) 、容积(ml)或表 面积(cm2)食品检样所产生的细菌菌落形 成

2、单位数(colony forming units,CFU)。 菌落总数 total colony number 细菌总数(total bacteria number)是死的、活的细胞的总数。 大肠菌群 大肠菌群系指一群在 37能发酵乳糖、产酸、产 气、需氧和兼性厌氧的革兰 氏阴性的无芽胞杆菌。 coliform group 我国和许多国家均采用相当于100ml(g) 食品检样中大肠菌群的最大可能数（most probable number,MPN）来表示。 致病菌 致病菌即能够引起人们发病的细菌。 对不同的食品和不同的场合，应该选择一定 的参考菌群进行检验: 海产品以副溶血性弧菌作为参考菌群

3、蛋与蛋制品以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、变形 杆菌等作为参考菌群 米、面类食品以蜡样芽孢杆菌、变形杆菌、霉菌 等作为参考菌群 罐头食品以耐热性芽孢菌作为参考菌群等等 霉菌及其毒素 我国还没有制定出霉菌的具体指标 ，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起 疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。 例如：曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等， 青霉属的桔青霉、岛青霉等，镰刀霉属 的串珠镰刀霉，禾谷镰刀霉等等。 食品微 生 物 实验室检 验菌落总数 的流 程 图 无菌取样 样品均质 样品接种 恒温培养 结果观察 样液稀释 本章教学目标 了解菌落总数的含义和测定意义，掌握菌落总 数测定的方法；了解大肠菌群的含义和测定意义， 掌

4、握大肠菌群的检测方法；了解食品中几种常见致 病的检测方法及其原理。 本章教学重点与难点 重点：菌落总数、大肠菌群的含义及测定方法；食 品中常见致病菌种类的生物学特性及检验方法。 难点：菌落总数测定的计数和报告；如何根据大肠 菌群的生物学特性及试验结果判别大肠菌群的真假 。食品中常见致病菌的检测方法及其原理。 3.1食品中菌落总数的测定 3.2食品中大肠菌群的检测 3.3食品中常见的致病菌的检测 第三章目录 3.1.1菌落总数的概 念及测定意义 3.1.2菌落总数的常 规检测方法 3.1.3菌落总数的其 它检测方法 3.1食品中菌落总数的测定 3.1.1菌落总数的概念及测定意义 指食品检样经过处

5、理，在 一定条件下（如需氧情况、 营养条件、pH、培养温度 和时间等）培养后，单位 重量(g) 、容积(ml)或表面 积(cm2)中所产生的细菌菌落形成单位数 (colony forming units,CFU)。 3.1.1.1菌落总数的概念 菌落计数法 方法：定量样品经稀释后接种于固体培养基， 经过培养，根据培养基上出现的菌落数检测样 品中活菌含量。 原理：一个活菌体在固体培养基上经过生长繁 殖可以形成一个菌落 菌落计数法不能检测出样品中实际的总活菌数 常见菌落计数法 平板菌落计数法 螺旋接种法 疏水网膜滤器法 Hungate滚管计数法 纸片法 3.1.1.2菌落总数的测定意义 可以判定食

6、品被细菌污染的程度 观察细菌在食品中的繁殖动态 及时反映食品加工过程是否符合卫生要求 从而对被检食品做出适当的卫生学评价。 通常认为，菌落总数的多少在一定程 度上标志着食品卫生质量的优劣。 通过测定菌落总数 3.1.2菌落总数的常规检测方法 (GB 4789.22010) 5.1.2.1检验前准备 5.1.2.2检验程序 5.1.2.3检验方法及步骤 3.1.2.1检验前准备 设备和材料：电热恒温培养箱（361） 、冰箱（04） 、恒温水浴锅（461 ） 、天平、电炉、吸管、广口瓶、三角瓶 、玻璃珠、平皿、试管、试管架、酒精灯、 均质器或乳钵、无菌刀或剪刀、无菌镊子、 75%酒精棉球、玻璃蜡笔

7、、登记薄 培养基和试剂：75%乙醇、无菌生理盐水、 15%氢氧化钠溶液、营养琼脂培养基 无菌室灭菌 融化培养基并置于恒温水浴锅（461）内保 温 标记培养皿及稀释剂试管 10-110-210-310-510-4 培养基名称 检样稀释度 检测者姓名 检测日期 3.1.2.1检验前准备 3.1.2.2检验程序 检样 做成几个适当倍数的稀释液 选择2-3个适宜稀释度 各以1ml之量分别加入无菌平皿内 每皿内加入461适量营养琼脂 菌落计数 报告 恒温培养 3.1.2.3检验方法及步骤 (1)检样稀释 (2)接种 (3)培养 (4)菌落计数 (5)报告 (1)检样稀释 准确称取25g(mL)样品，经

8、适当处理后，用10倍递增稀释 法做成几个倍数适宜的稀释液 。 9ml无菌稀释剂 25g（ml ）样品 225ml无 菌稀释剂 1/107 9ml无菌 稀释剂 无菌操作 以无菌操作，将检样25g（或25ml）剪碎以后 ，放于含有225ml无生理盐水或其他稀释液的 灭菌玻璃瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠 ）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1： 10的均匀稀释液。 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁 徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释的 试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液， 下同），振摇试管混合均匀，做成1：100的稀 释液。 另取1ml的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍

9、 递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1 支1ml灭菌吸管。 具体操作步骤 检样稀释的注意事项 各步骤一定要严格的做到无 菌操作。 为减少样品稀释倍数的误差 ，在连续递增稀释时，每一 稀释液应充分振摇均匀，同 时每递增稀释一次，必须更 换一支吸管。 吸管尖端不能伸入无菌水，以防 吸管尖端外部粘附的检样匀液也 混入其中，影响稀释倍数的准确 。 国家标准方法规定的稀释剂一般 是无菌生理盐水或无菌蒸馏水， 有时采用磷酸缓冲液或0.1的蛋 白胨水，后者对已受伤的细菌细 胞有一定的保护作用。含盐量较 高的食品(如酱品等)进行稀释时 宜采用无菌蒸馏水。 检样稀释的注意事项 (2) 接种 方法梗概：根据食

10、品卫生标准要求或对 样品污染情况的估计，选择23个稀释 度的稀释液，用倾注法或涂布法进行平 板接种，每个稀释度做两个平行试验。 实际操作中，检样稀释和接种交叉 进行更为合理，可使操作步骤更简便， 并降低受污染的机率。 检样稀释液的移取：根据食品卫生标准要求或 对检样污染情况的估计，选择23个适宜稀释 度，分别在作10倍递增稀释的同时，以同一支 吸管移取1ml稀释液于无菌平皿内，每个稀释度 作两个平皿。 倒平板：稀释液移入平皿后，应及时将凉至 461营养琼脂培养基注入平皿15ml-20mL， 并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养 基倾入加有1ml稀释剂（不含样品）的无菌平皿 内作空白对照。

11、倾注法接种具体操作步骤 9ml无菌稀释剂 25g（ml ）样品 225ml无 菌稀释剂 1/107 9ml无菌 稀释剂 2 1ml1ml1ml 转动混匀 倒平板 移取 样液 倾注法操 作流程图 25g（ml ）样品 225ml无 菌稀释剂 9ml无菌 稀释剂 1/107 0.2ml0.2ml0.2ml 11 12 2 倒平板 涂布法操作流程图 移取检样匀液时，吸管尖端不能触及任何物品 ，以免污染。 以倾注法接种时，倒平板的培养基必须冷却至 46时使用，过热会杀死细菌，过冷则不能使样 品稀释液与其混匀。 为防止细菌数量在试验期间发生变化，应尽量 缩短稀释和接种的时间，一般不宜超过20min。 要

12、做空白对照平板，以便于判断试验结果是否 可靠，并有利于区别菌落和平板中的异物颗粒。 接种的注意事项 (3) 培养 培养温度根据食品种类而定：水产品多采用 30，其它食品等均在37下培养。 培养时间均为482h 培养时将平板翻转培养， 可以避免菌落蔓延生长。 将接种后的冷凝平板在适当温度下恒温 培养，使平板上形成菌落的检测过程。 (4)菌落计数 培养结束后，根据平板上出现的菌落数及 相应的样品稀释倍数计算出食品检样菌落总数 的过程。 用肉眼（必要时用放大镜检查）或菌落计数 器对平板上出现的菌落数进行统计并记录 根据记录求出同一稀释度两个平板的平均菌 落数 以平均菌落数乘以相应的稀释倍数，其乘积

13、就是被检样品的菌落总数。 一、具体操作步骤 培养至规定时间，应立即计数。如果不能立即计 数，应将平板放置于04，但不得超过24h。 选取菌落数在30300之间的平板计算菌落总数。 低于30的平板记录具体菌落数，高于300的则记录 为多不可记。 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采 用，应以无片状菌落的平板作为该稀释度的菌落 数。如片状菌落不到平板的一半，则另一半又分 布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板 的菌落数。 二、菌落计数注意事项 当平板上出现菌落间无明显界限链状生长时， 则将每条链作为一个菌落计算。 不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比(同一 稀释度的二个平板的菌落数应基

14、本接近)，即稀 释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数 愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差 错(有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮 料等)，不应作为检样计数报告的依据。 二、菌落计数注意事项 三、菌落总数的计算方法 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数 的范围，则以平均菌落数乘以相应的稀释倍数 ，作为被检样品的菌落总数。 若有二个稀释度平板上的菌落数均在适宜计数 的范围，则按以下公式计算： Nc/(n10.1n2)d N：样品中菌落数 c：二个稀释度所有平板上菌落数之和 n1：第一稀释度平板个数 n2：第二稀释度平板个数 d：稀释因子（第一稀释度） 稀释度110011000 平

15、板上菌落数232，24433，35 示例： Nc/(n10.1n2)d (2322443335)/(20.12)10-2 544/0.022 24727 03版：（应以二者比值决定，比值2取平 均数，比值2则取其较小数字。） 若所有稀释度均300时以最高稀释度的平均 菌落数乘以稀释倍数报告； 若所有稀释度均30时以最低稀释度的平均菌 落数乘以稀释倍数报告。 如均不在30300之间，则以最接近300或30的 平均菌落数乘以稀释倍数报告。 如所有稀释度均无菌落生长，则应按1乘以 最低稀释倍数报告。 三、菌落总数的计算方法 (5)报告 菌落数100时，按四舍五入原则修约，以整数报告 。菌落数或100时，第三位数字采用四舍五入原 则修约后取前两位数字，后面用0代替位数。也可用 10的指数形式表示，按四舍五入原则修约后，采用两 位有效数字。 固体检样以克(g)为单位报告，液体检样以毫升(mL) 为单位报告，表面涂擦则以平方厘米(cm2)为单位报 告。 若所有平板上菌落接蔓延生长，则报告为菌落蔓延。 若空白对照上有菌落生长，则检