动物细胞培养和核移植技术(上课用)[]

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1、动物细胞培养和核移植技术 第一课时 动物细胞工程常用的技术手段： 动物细胞培养、 动物细胞核移植、 动物细胞融合、 单克隆抗体 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的 基础。 提问： v植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养, 植物体细胞杂交 从动物机体中取出相关组织，将它们从动物机体中取出相关组织，将它们分分 散成单个细胞散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，然后放在适宜的培养基中， 让这些细胞生长和增殖。让这些细胞生长和增殖。 一、动物细胞培养一、动物细胞培养 1 1 、动物细胞培养的概念、动物细胞培养的概念 动物组织块动物组织块 细胞悬液细胞悬液 原代培养原代培养 传代培养传

2、代培养 胰蛋白酶或胶原蛋白酶胰蛋白酶或胶原蛋白酶 处理分散成单个细胞处理分散成单个细胞 （幼龄动物的器官、组织或胚胎）（幼龄动物的器官、组织或胚胎） 加入培养液加入培养液 用胰蛋白酶等处理贴壁细胞，使细用胰蛋白酶等处理贴壁细胞，使细 胞从瓶壁脱落胞从瓶壁脱落 适宜条件适宜条件 2.2.动物细动物细 胞培养的胞培养的 过程过程 细胞细胞 悬浮液悬浮液 细胞贴细胞贴 满瓶壁满瓶壁 5050代代 细胞细胞 原代原代 培养培养 传代传代 培养培养 原代培养原代培养: : 将动物组织经胰蛋白酶等处理后的初次培养。将动物组织经胰蛋白酶等处理后的初次培养。 传代培养传代培养: : 对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶

3、处理，然后再分对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分 瓶继续培养。瓶继续培养。 动物组织动物组织 单个细胞单个细胞 细胞悬细胞悬 液液 贴壁生贴壁生 长长 分瓶培分瓶培 养养 10 代 细 胞 50 代 细 胞 不 死 细 胞 原代培养原代培养 传代培养传代培养 胰蛋白酶胰蛋白酶 或胶原蛋或胶原蛋 白酶白酶 剪碎剪碎加培养液加培养液 接触抑制接触抑制 少数癌变少数癌变 少数少数 动物细胞培养技术流程动物细胞培养技术流程 失去接触失去接触 抑制现象抑制现象 细胞核型 不变 当贴壁细胞生长到表面相当贴壁细胞生长到表面相 互接触时，细胞就会停止分裂互接触时，细胞就会停止分裂 增殖增殖细胞出现接触抑

4、制细胞出现接触抑制。 哪些细胞失去了接触抑制？哪些细胞失去了接触抑制？ 传代培养时，少数超过传代培养时，少数超过5050 代的细胞，由于遗传物质发生代的细胞，由于遗传物质发生 改变，可无限增殖，并失去了改变，可无限增殖，并失去了 接触抑制接触抑制肿瘤细胞肿瘤细胞。 接触抑制接触抑制 动物胚胎或幼龄动 物的组织、器官 细胞悬浮液 胰蛋白酶 10代细胞 50代细胞 细胞株 无限传代（不死 性） 细胞系 遗传物质 改变 遗传物质未 改变 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中 ，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题 ： 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？

5、 P46讨 论 充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元 素等合成成分及血清、血浆等天然成分。） 适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境 4、动物细胞培养条件： 1、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液） 2、营养 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。） 3、温度和PH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4 4、气体环境： O2和CO2（95%空气和5% CO2 ） 保证细胞顺利的 生长增殖 维持培养液的PH 5、动物细胞培养应用 大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干 扰素、单克隆抗体） 作为基因工程中的受体细胞 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，

6、判断某种物质的毒性 为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依 据 思考： 2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞 培养材料？ 1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独 特之处？ 3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？ 4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个 体？ 主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。 独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等 因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强 成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养 不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的 动物个体 细胞的全能性

7、 细胞株、细胞系 植物体或组织培养结果 获得细胞 或细胞分泌蛋白 快速繁殖、培育 无病毒植株等 培养目的 葡萄糖、动物血清 蔗糖、植物激素 培养基特有成分 液体培养基固体培养基培养基性质 细胞增殖 原理 动物细胞培养 植物组织培养 比较项目 第二课时 动物细胞培养和核移植技术 二二. .动物细胞动物细胞核移植技术和克隆动物核移植技术和克隆动物 将动物的一个细胞核，移入一个已经将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞去掉细胞 核的卵母细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚中，使其重组并发育成为一个新的胚 胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物克

8、隆动物 ）。 分分 类类 胚胎细胞核移植：胚胎细胞核移植： 体细胞核移植：体细胞核移植： 细胞分化程度低，细胞分化程度低， 恢复全能性容易；恢复全能性容易； 细胞分化程度细胞分化程度高高， 恢复全能性恢复全能性不不容易容易 1.1.动物细胞动物细胞核移植概念：核移植概念： （难度高难度高） 卵母细胞 母绵羊 母绵羊 乳腺细胞 细胞质 细胞核 细胞核移植 早期胚胎 卵裂 C母绵羊子宫 胚胎移植 多莉羊 分娩妊娠 多莉羊的培育过程 融合后的卵母细胞 2、体细胞核移植的过程： 请看教材P48图2-21 思考： 1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细 胞作为受体细胞有什么好处？ 2.通过什么

9、手段激活受体细胞，构建重组胚胎？ M中期卵母细胞 诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成 细胞分裂和发育进程。 卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富， 提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体 现全能性的物质。 电激处理使供电激处理使供 体核进入受体体核进入受体 卵母细胞构建卵母细胞构建 重组胚胎重组胚胎 卵母细胞采集、培养卵母细胞采集、培养 MM中中期期卵母细胞卵母细胞 供体牛供体牛 供体细胞注入供体细胞注入 去核卵母细胞去核卵母细胞 代孕母牛代孕母牛克隆牛克隆牛 体细胞培养体细胞培养 去核卵母细胞去核卵母细胞 去核去核 胚胎胚胎 移植移植 2.2.体细胞核移植过程体细胞核移植

10、过程 （体细胞克隆动物）（体细胞克隆动物） 原理：动物细胞核具有全能性 显微 操作 3.3.体细胞核移植技术的应用前景：体细胞核移植技术的应用前景： 1.1.加速家畜遗传改良的加速家畜遗传改良的 进程进程 2.2.保护濒危物种保护濒危物种 3.3. 生产医用蛋白质及生产医用蛋白质及 组织器官的移植组织器官的移植 4.4.了解胚胎发育和衰老了解胚胎发育和衰老 过程；追踪研究疾病的过程；追踪研究疾病的 发展过程和治疗疾病发展过程和治疗疾病 4 4、体细胞核移植技术存在的问题、体细胞核移植技术存在的问题 P173P173 （1 1）成功率非常低）成功率非常低 （2 2）克隆动物以表现早衰、生理缺陷等

11、健康问）克隆动物以表现早衰、生理缺陷等健康问 题题 成功率低，绝大多数克隆动物存在健康问成功率低，绝大多数克隆动物存在健康问 题并表现出遗传和生理缺陷：如体型过大，异题并表现出遗传和生理缺陷：如体型过大，异 常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。 讨论：（教材P49） 1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之 前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？ 为使核移植的胚胎或动物的遗 传物质全部来自有重要利用价值的动 物提供的体细胞，在供体细胞的细胞 核移至受体细胞之前，必须将受体细 胞的遗传物质去掉或将其破坏。 培养的动物细胞一般当传代至10 50代左右时，

12、部分细胞核型可能会发生 变化，其细胞遗传物质可能会发生突变 ，而10代以内的细胞一般能保持正常的 二倍体核型。因此，在体细胞核移植中 ，为了保证供体细胞正常的遗传基础， 通常采用传代10代以内的细胞。 2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代 10代以内的细胞，想一想，这是为什么？ 3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动 物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？ 为什么？ 克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核，但 其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来 自于受体卵母细胞。 此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些 行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动 物生活

13、的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同 ，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相 同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100% 的复制。 1.动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动 物的组织或器官，请解释原因。 细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞 的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能 力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般 来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于 培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力 越强，所以更容易培养。 肿瘤组织或细胞 正常组织或细胞 拓展-动物组织或细胞培养的难易程度 幼体组织或细胞 老龄组织或细胞 分化

14、程度低的组织或细胞 分化程度高的组织或细胞 思考与探究（教材P50） 思考与探究（教材P50） 2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？ 动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高 度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了 发育成完整个体的能力，所以，动物细胞 也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱 分化过程了。要想使培养的动物细胞定向 分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使 其分化成所需要的组织或器官。 3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（ Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶 量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量 一般为十几吨

15、，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为34 t。 （1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说 明理由。 可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础 ，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本 上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础 ，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广 ，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高 产的后代，从而加快奶牛改良进程。 该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤 其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出 现近亲繁殖而引起种质衰退。 （2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何 对它进行克隆？ 从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，

16、耳朵在活体 上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组 织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢 ，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细 胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使 卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵 母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核 的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植 胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入 经同期发情处理的受体母牛体内。 4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么 问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。 研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制 尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形 率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些 问题尚在研究中。 应用