高中人教版生物选修三基因工程基本实际操作程序讲义

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1、人教版选修3 专题1 基因工程 课题2 基因工程的基本操作程序 基因工程 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的 设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予 生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新 的生物类型和生物产品。（既是概念，又是原理） 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 基因工程基本操作的四个步骤 有了目的基因，我们才 能赋予一种生物以另一 种生物的遗传特性。 使目的基因在受体细胞 中稳定存在，并可进行 遗传、表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定 表达，才能实现一种生 物的基因在另一种生物 中的转化。 才能确定目的基

2、因是否 真正在受体细胞中稳定 遗传和正确表达。 一、目的基因的获取 (一)、目的基因主要是_ 编码蛋白质的结构基因 请举出三个以上的例子 （二）、获取目的基因的常用方法有哪些? 1.从基因文库中获取 2.利用PCR技术扩增 3.人工合成 请阅读P9第一和二两段 一、目的基因的获取 （一）从基因文库中直接获取 1.基因文库：概念见P9 2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类 种类 基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因 部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库 3.获取目的基因的根据： 见课本P9 某生物体内全部DNA 许多DNA片段 受体菌群体 4.基因文库的构建

3、方法 限制酶 与运载体连接 导入 基因组文库 某种生物某个时期的mRNA cDNA 反转录 受体菌群体 与运载体连接 导入 部分基因文库 （cDNA文库） 基因组DNA文库的构建 通过对受体 菌的培养而 储存基因 文库类型cDNA 文库基因组文库 文库大小小大 基因中启动子（具有启 动作用的DNA片段） 无有 基因中内含子（位于编 码蛋白质序列内的非编 码DNA片段） 无有 基因多少某种生物的 部分基因 某种生物的全 部基因 物种间的基因交流可以部分基因可以 5.基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术 条件：_、 _ 、 _

4、、 _ 原理：_ 方式：以_方式扩增，即_（n为扩增 循环的次数） 结果： 多聚酶链式反应 体外特定DNA片段 DNA复制 已知基因的核苷酸序列（前提） 四种脱氧核苷酸一对引物 耐热的DNA聚合酶（Taq酶） 指数2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 (二)利用PCR技术扩增目的基因 过程： a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_ b、退火（复性55-60）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物处延伸，合成与模板互补 的_。 氢键单链DNA 双链 DNA链 过程：过程： 高温变性（

5、9095） 低温退火（ 5560） 中温延伸（ 7075） 多次 重复 加热至9095目的 基因DNA解链 冷却至5560，引 物结合到互补DNA链 加热至7075，热 稳定DNA聚合酶从引物起 始互补链的合成 (二)利用PCR技术扩增目的基因 注意：一对引物（一对寡核苷酸序列）： 与目的基因的起始段互补。 一段已知目的基因的核苷酸序列，以便 根据这一序列合成引物 前提：前提： 双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA 的，因此整个过程不需要解旋酶。 PCR技术扩增与DNA复制的比较 PCR技术DNA复制 相 同 点 原理 原料 条件 不 同 点 解旋 方式 场所 酶 结果 碱基互补配对 四种

6、脱氧核苷酸 模板、能量、酶 DNA在高温下变性解旋解旋酶催化 体外复制细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 大量的DNA片段形成整个DNA分子 蛋白质 的氨基 酸序列 mRNA 的核苷 酸序列 结构基因 的核苷酸 序列 目的 基因 推测推测化学 合成 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： （三）人工合成的目的基因 二、基因表达载体的构建基因工程的核心 目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在， 并且可以遗传给下一代，同时使目的 基因能够表达和发挥作用。 2、表达载体的组成 1）启动子 2）终止子 3）目的基因 4）标记基因等 它们各自的作用是什么 ? 启动子：位于基因的首端的一

7、段特殊的DNA片断，它是RNA聚 合酶识别和结合的部位，有了 它才能驱动基因转录出mRNA， 最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一 段特殊的DNA片断，能终止 mRNA的转录 标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的 基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。 质粒DNA分子 限制酶处理 二个切口 两个黏性末端 四个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 3、过程: 载体与表达载体的区别：二者都有标记基因 和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体 基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部 分结构 用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又 用到DNA连接酶将

8、目的基因和载体拼接，两种 酶作用的化学键都是磷酸二酯键 启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表 达载体的方式携带进去。 注意 三、将目的基因导入受体细胞 （一）转化： （二）方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞 目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程 受体细胞 稳定表达 1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法 农杆菌特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多 数单子叶植物没有感染能力 原理：Ti质粒上的T-DNA可以

9、转 移到受体细胞，并整合到受体细胞染 色体的DNA上。 过程： 优点 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌导入 植物细胞 整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达 （2）基因枪法 （3）花粉管通道法 2、将目的基因导入动物细胞 方法：显微注射法 程序： 目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物 3、将目的基因导入微生物细胞 原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 方法： 用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表 达载体与感受态细胞混合 感受态 细胞吸收DNA分子 四、目的基因的检测与鉴定 检查是否成功 （一）、检测 1、检测转基因生物染色体的D

10、NA上是否插入 了目的基因 (关键步骤) 首先取出转基因生物的基因组DNA 用含目的基因的DNA片段用放射性同位素 等作标记,以此做探针 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示 出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中 （1）方法: DNA分子杂交 （2）过程: 归纳步骤 检测目的基因是否转录出了mRNA 提取受体生 物的mRNA 用同位素标记的 目的基因片段杂交 显 出 杂交带 （表明目的基因已转录出了mRNA） 检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA 利用的是DNA与mRNA杂交。 检测目的基因是否翻译出蛋白质 抗原抗体杂交技术 提取受体生 物的蛋白质 与相应抗体杂交 显 出

11、杂交带 （表明目的基因已形成蛋白质产品） DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分 子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补 的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合 在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序 列的部位，仍然是两条游离的单链。 P15思考与探究 （二）、鉴定（个体生物学水平） 2、检测目的基因是否转录出了mRNA 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 方法:分 子 杂 交 方法: 抗原抗体杂交 过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交, 若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA 归纳步骤 (四)目的基因的检测与鉴定 检查是

12、否成功 检测 (分子 水平) 鉴定 （个体水平） 检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 方法 方法 方法 DNA分子杂交 分子杂交（注意与上不同之处） 抗原抗体杂交 归纳: 基因工程的基本操作程序 1.获取目的基因 u从基因文库 u利用PCR u化学方法人工合成 2.构建基因表达载体 u目的基因、启动子、终止子、标记基因 3.将目的基因导入受体细胞 u农杆菌转化法、显微注射法 4.目的基因的检测与鉴定 u检测：是否插入、转录、翻译 u鉴定： 练习1：为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河

13、三 角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应 用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限 制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用 于 处。（填“a”或“b”） a a 练习1：为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河 三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家 应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方 法有农杆菌转化法和 法。 （3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要 利用 技术，该技术的核心是 和 。 （4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既 要用放射性同位素标记的 作探针进行 分子杂交检测

14、，又要用 方 法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。 基因枪法（花粉管通道法） 植物组织培养 脱分化和再分化 耐盐基因 一定浓度盐水浇灌 1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来 C 练习 2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA D 练习 3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶 A 练习 4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供 资料 D 练习 5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计 施工的。