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1、高通量药物筛选与创新药物研究 中国科学院上海药物研究所 国家新药筛选中心 李佳 内容 高通量药物筛选： 模型建立、化合物制备、自动化、数据处理 我国高通量药物筛选的现状 我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的策略： 组合筛选模型体系、分子家族筛选模型体系、化学生物学方法研究活 性化合物作用机制 我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的研究实例 化合物资源 药物发现 DRUG DISCOVERY 药物开发 DRUG DEVELOPMENT 1. 临床前研究 2. 临床研究 药物候选化合物 药 新 1.药物先导化合物的发现 2.药物先导化合物的结构优化 新 药 研 究 的 两 个 阶 段 分子生
2、物学 细胞生物学 基因组学 蛋白组学 生物信息学 结构生物学 计算机辅助药物设计 药物化学 高通量筛选 技术 天然产物 化学合成 组合化学 化合物库 筛选模型 结构优化先导化合物 筛选 药物发现的关键环节 高新技术集中的焦点 高通量筛选（HTS） 运用自动化的筛选系统在短时间内、在特定的 筛选模型上完成数以千计，甚至万计化合物样品的 活性测试。一般而言，日筛选能力应在10000次以上 方可以称为高通量筛选。 The Evolution of HTS 高通量筛选 快速-每天筛选上万药次 微量-筛选样品需要量为微克级 灵敏-准确判断筛选样品的活性和选择性 经济-筛选费用低 常规筛选 高通量筛选 常
3、规筛选和高通量筛选 高通量筛选筛选 的四个要素 样品制备 自动化 HTS 模型建立 数据处理 要素一：高通量筛选模型建立 针对某一特定靶点，设计一种生物活性检测方法并 使之适用于高通量筛选。 选择高通量筛选的靶点 来源于基础科学对于一种疾病进行细致研究后的理 解和发现。根据这些结果，我们可以选择其中关键 的生物效应环节进行干预。这些靶点包括受体、酶 、激素、因子、离子通道和蛋白间的相互作用等。 Current Drug Targets Membrane Receptors45% Enzymes28% Hormones and Factors11% Ion Channels5% DNA2% Nu
4、clear Receptors2% Unknown7% N = 483 J. Drews, Science (2000) 287:1962 靶点确证 Expression phenotype ? Mutant ? Antisense treatment ? Antibody treatment ? RNAi ? Knockout / knockin ? Inhibitor treatment ? 克隆 PCR、RT-PCR方 法从cDNA文库、 EST克隆、组织和 细胞的总RNA中 得到关键靶基因 亚克隆 大肠杆菌表达系 统 酵母表达系统 昆虫表达系统 大规模表达、 纯化、复性， 得到纯净重组
5、 蛋白 时间 光吸收 E412nm =13,600 M-1cm -1 检测方法的确 定、优化及高 通量筛选模型 的建立 分子水平筛选模型建立流程 模型设计 体外生化检测 通常通过体外生化检测方法进行筛选的靶点包括酶、 受体、蛋白与蛋白的相互作用等 细胞水平的检测 主要用于信号传导通路相关的靶点（包括受体、离子 通道）以及为发现抗生素设计的筛选模型 通过显色反应、荧光、化学发光以及同位素检测 技术测量生物反应的终点。 体外生化检测 显色反应 (Photometry) 显色反应方法检测MetAP活性 显色反应方法检测MetAP活性 荧光强度 (Fluorescence Intensity) 7-a
6、mino-4-methylcoumarinrhodamine 110resorufin Fluorogenic Peptide Substrate 荧光偏振 (Fluorescence Polarization) FP Theoretical FP Behavior of a Series of Fluorescent Dyes As a Function of MW 尺寸变化 IMAP Protein-DNA Binding FP HTS Ser/Th Kinase Competitive FP Assay 荧光共振能转移(FRET) 荧光共振能转移是指供体受激发后不发射出光子而将 激发的能
7、量转移到受体的现象。这种方法可检测生理 状态下相互作用分子间的距离。产生FRET需要满足三 个条件：供体和受体间距离接近（10100埃）；供体 的发射光谱与受体的激发光谱必须有重叠；供体和受 体之间迁移偶极子的方向必须平行。 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) FluorescenceFluorescence DA Efficient energy transfer: 10100 Absorbance Wavelength Absorbance Wavelength Donor Acceptor 荧光共振能转移 在大多数情况下，供体与受体
8、标记的荧光染料是不同 的，供体的荧光会因为受体的存在而发生淬灭。一般 荧光素和四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine）之 间发生50%有效能量转移所需距离为55 埃，EDANS和 DABCYL之间为33埃，EDANS和荧光素之间为46埃。 FRET主要用于淬灭分析或与淬灭相关的分析。 Fluorogenic (Quenched) Substrate FRET Example of use of FRET in a protease assay Matayoshi et al., Science 247 954 (1990) 时间分辨荧光共振能传递 （Time Resolved
9、FRET） LANCE Assay for Kinase LANCE Assay for Transferase and Nuclear receptor LANCE Assay for Protease and Helicase AlphaScreen AlphaScreen for PIP3 AlphaScreen for cAMP BRET 闪烁亲近检测法 (Scintillation Proximity Assay, SPA) FlashPlate - SPA without Beads Bind Receptor Or Target to Plate Radiolabeled Tra
10、cer and Sample added Only bound Tracer is Measured 常用的蛋白水解酶检测方法 常用的蛋白水解酶检测方法 常用的激酶检测方法 常用的磷酸酯酶检测方法 以酶为靶点 以酶为靶点进行的高通量筛选的优化及标准化涉及 以下几个步骤： 确定反应条件（如缓冲液、pH、温度） 天然或合成的底物的确定 酶动力学 信号窗口的评价 对已知抑制剂的反应情况 底物转变为产物后，分别使用显色反应、荧光或放 射性化学的方法等。适用的靶点不仅包括蛋白酶、 激酶和磷酸酯酶，也包括其它酶类，如DNA连接酶和 解旋酶。 细胞水平检测 荧光成像检测(FLIPR) 贴壁细胞或悬浮细胞中F
11、luo-3的荧光强度，间接反 映钙离子的浓度。在FLIPR实验中，可以用96孔或 384孔板对多个样品同时检测，测定荧光强度的过程 仅需1秒。可进行钙离子内流的动力学检测。 FLIPR functional screening assay L GTPGDP PLC inositol phosphates Ca2+ Fluorescent dye + fluorescent signal 报告基因 报告基因受一个可诱导转录因子的调控，从而响应 受体的活动，并指导报告蛋白的合成。 对应不同的细胞株，可有多种报告基因和载体可供 选择。常用的有萤火虫荧光素酶(luciferase)、分泌 型碱性磷酸酯
12、酶(secreted alakaline phosphatase, SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(chloramiphenicol acetyltransferase, CAT)、-半乳糖苷酶(- galactosidase)、-内酰胺酶和绿色荧光蛋白(GFP) 。 Reporter Gene Bait Protein Binding Domain Prey Protein Activation Domain Two hybrid proteins are generated with transcription factor domains Both fusions are expresse
13、d in a yeast cell that carries a reporter gene whose expression is under the control of binding sites for the DNA-binding domain The Two-Hybrid System Reporter Gene Bait Protein Binding Domain Prey Protein Activation Domain The Two-Hybrid System Interaction of bait and prey proteins localizes the ac
14、tivation domain to the reporter gene, thus activating transcription. Since the reporter gene typically codes for a survival factor, yeast colonies will grow only when an interaction occurs. Quantum dots Invitrogen 公司的Qdot技术 Quantum dots 是一种与蛋白质尺寸相当的半导 体材料，具有独特的荧光特性。已成为筛选药物 的有利工具。 荧光持续时间时间长，适合时间分辨检测。
15、 颜色多样，在同一激发波下，不同尺寸的微利可发 出多种激发光，加上其表面可以耦联多种生物分子 ，可同时标记多个靶点。 安全：细胞毒性低，可用于活细胞或者体内研究。 Qdot的结构 High Content Screening High Content Screening Cellomics ArrayScan KineticScan Molecular Devices Discovery-1 Visualize and analyze cell populations Identify sub-cellular protein localization Perform multi-parameter analysis Live cell assays to detect translocation of signaling proteins: primary screening lead profiling Pathway screening for functional effect, rather than specific mode of action (e.g.: in vitro binding, catalytic activity). Modulation of protein translocation
