培训班教材微生物部分

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1、第五部分 食品微生物检测基础 第一章 食品分析概论 第二章 微生物检测程序 第三章 菌落总数的测定 第四章 霉菌和酵母菌的计数 第五章 大肠菌群的测定 第六章 实验室生物安全基本知识 第一章 食品分析概论 l微生物是一群形体非常微小，肉眼看不 到或很难看清它的个体的生物。比如中 等大小的细菌，1000个叠加在一起只有 句号那么大。想象一下每毫升腐败的牛 奶中约有50亿个细菌，或者讲毎夸脱牛 奶中细菌总数约为5千万，也就是一滴 牛奶含有5千万细菌。 第一节 食品微生物简介 l微生物种类多，分布广，有些微生物 起着有益的作用，有些微生物起着有 害的作用。微生物对于食品来说关系 尤为密切，很多微生物

2、可应用于食品 制造，如制酒、醋、面包、泡菜以及 制造菌体蛋白等。但是，有些微生物 能引起食物变质败坏，即引起食品气 味和组织结构发生不良变化；少数微 生物能产生毒素，引起食物中毒或引 起人、动植物病害。 l微生物除了具有其他生物共同具有的 特性，如遗传性和变异性以外，还具 有以下一些特性： l个体微小，结构简单。 l分布广，种类多。 l繁殖快，数量大。 l易于变异，适应力强。 l易于培养，代谢活力强。 第二节 食品微生物检测所涉及 的类群 l食品微生物检测所涉及的类群 （按有无细胞结构分）： 微生物 非细胞生物病毒细胞生物 原核生物细菌 真核生物酵母菌、霉菌 第三节 食品微生物检测的意 义和任

3、务 l食品是人类赖以生存所必需的物质之一， 提供安全卫生、营养丰富的食品，是保证人 类生存和身体健康的基本要求。食品在生产 、加工、储备、运输和销售等各个环节都可 能受到环境中各种因素的影响和污染，微生 物污染尤为常见。因此对食品微生物的检验 至关重要。 l通过对食品微生物的检验，能够对食品被 污染的程度作出评价，为其卫生管理提供科 学依据。对微生物的检验结果是衡量食品卫 生质量的主要指标之一。微生物的检测不仅 利于保障人民身体健康，而且对扩大世界贸 易与对外交流具有重大的政治和经济意义。 第二章 微生物检测程序 第一节 样品的采集 l采样必须在无菌操作下进行，所有与样 品接触的用具（探子、铲

4、子、匙、采样器 、试管等）都应经过灭菌。采样时应根据 样品的种类如袋、瓶和罐装的，应取完整 未开封的包装；若样品很大，应用无菌采 样器采样；若样品是固体粉末，应边取边 混合；是液体，应振摇混匀后取样；若是 冷冻食品，采样后应保持在冷冻状态（可 放在冰内、冰箱内保存），非冷冻食品需 在05下保存。样品采好后应贴上标签 ，写明品名、来源、数量、采样地点、采 样人及采样时间。总之，定型包装及散装 均采样250g l样品采好后送到微生物实验室检验，最 好不要超过三小时。 l微生物检验室接到送检申请单，应立即 登记，填写实验序号，并按检验要求， 立即将样品放在冰箱中，积极准备条件 进行检验。 l各食品卫

5、生微生物检验室必须备有专用 冰箱存放样品。一般阳性样品在报告发 第二节 样品的微生物检验 出后3天（特殊情况可适当延长）方能处 理样品。进口食品的阳性样品，需保存6 个月后方能处理，以便复验和再次证明 。阴性样品可及时处理。 l检验完后，检验人员应及时填写报告单 ，签名后，送主管人员核实签字，加盖 单位印章，以示生效 第三章 菌落总数的测定 l定义：食品检样经过处理，在一定条件 下培养后（如培养基成分、培养温度和 时间、PH、需氧性质等），所得1mL(g) 检样中所含菌落的总数。本方法规定培 养条件下所得结果，只包括一群在平板 计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或 兼性厌氧的菌落总数。 l菌落总

6、数主要是作为食品被污染程度的 标志。 l冰箱： 04 l恒温培养箱：361 l恒温水浴锅：461 l均质器或灭菌乳钵 l药物架盘天平：0 500g，精确至 0.5g l放大镜 4 l灭菌吸管：1mL、10mL l灭菌锥形瓶：500mL l灭菌培养皿：直径90mm l灭菌试管、玻璃珠、刀、剪子、镊子 等 第一节 设备和材料 l检样稀释及培养 第二节 检验程序 l以无菌操作将检样25g（mL）剪碎放于 含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液灭 菌玻璃瓶内（瓶内预置适当玻璃珠）或 灭菌乳钵内，经充分震荡或研磨做成 1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀 释液后，最好置均质器中以8000r/min 1

7、0000r/min速度处理1 2min，做成 1:10的均匀稀释液。 l用1.0mL灭菌吸管吸取上述1:10稀释液 1.0mL，沿管壁徐徐注入含有9.0mL灭菌 生理盐水或其他稀释液的试管内（注意 吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇 试管，混合均匀，做成1:100的稀释液。 另取1.0mL灭菌吸管，按以上操作方法， 做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次 ，即换用1支1.0mL灭菌吸管。 l根据食品卫生标准要求或对标本污染情 况的估计，选择23个适宜稀释度，分 别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取 该稀释度的吸管移1.0mL稀释液于灭菌培 养皿内，每个稀释度做两个培养皿。 l稀释液移入培养皿后应

8、及时将凉至46 营养琼脂培养基（可放置与461 水浴 保温）注入培养皿约15mL，并转动培养 皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基 倾倒入加有1.0mL灭菌生理盐水或其他稀 释液的灭菌培养皿内作空白对照。 l待琼脂凝固后，翻转平板，置361培 养箱内培养48h2h。水产品301培养 箱内培养72h3h。 l如果样品中可能含有在琼脂培养基表面 弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂 表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL）， 凝固后翻转平板，按上述培养。 检样25g(mL) 作几个适当倍数的稀释液 选择23个适宜的稀释度 各取1.0mL分别加入灭菌培养皿内 每皿内加入适量（约15mL）平板计数琼脂培养基

9、菌落记数 报告 361 482h 2菌落计数的方法 l做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必 要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释 倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌 落形成单位（colony-forming units,CFU） 表示。 菌落计数 1.选取菌落数在30 300CFU之间、无蔓 延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可 记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采 用两个平板的平均数。 2.其中一个平板有较大片状菌落生长时， 则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板 作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平 板的一半，而其余一半中菌落分布有很均匀 ，即

10、可计算半个平板后乘以2代表一个平板。 3.当平板上出现菌落间无明显界线的链状 生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 菌落总数的计算方法 1.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适 宜的技术范围内，计算两个平板菌落数的平 均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为 每克（毫升）中菌落总数的结果。（见下表 例） 稀释液及菌落数 菌落总数 cfu/g(mL) 报告方式 cfu/g(mL) 10-110-210-3 多不可计1642016400 16000或 1.6104 2.若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜技术 范围内，按如下公式计算。（见下表例） N=C/(n10.1n2)d 式中： N样品中菌落数

11、； C平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数 之和； n1第一个适宜稀释度的平板数； n2第二个适宜稀释度的平板数； d稀释因子（第一稀释度）。 示例： 稀释液及菌落数 菌落总数 cfu/g(mL) 报告方式 cfu/g(mL) 10-110-210-3 多不可计 23233 2472725000或 2.510424435 N=C/(n10.1n2)d =(232+244+33+35)/(2+0.12) 10-2 =544/0.022 =24727 最后数据经“四舍五入”后表示。 3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300， 则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板 可记录为多不可计，结果按平均菌落

12、数乘以 最高稀释倍数计算。（见下表例） 稀释液及菌落数 菌落总数 cfu/g(mL) 报告方式 cfu/g(mL) 10-110-210-3 多不可计 多不可计313313000 310000或 3.1105 4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30， 则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍 数计算。（见下表例） 稀释液及菌落数 两稀释 度之比 菌落总数 cfu/g(mL) 报告方式 cfu/g(mL) 10-110-210-3 27115270 270或 2.7102 5.若所有稀释度（包括液体样品原液）平 板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍 数报告之。（见下表例） 稀释液及菌落数 菌落

13、总数 cfu/g(mL) 报告方式 cfu/g(mL) 10-110-210-3 00011010 6.若所有稀释度的平均菌落数均不在30 300之间，其中一部分大于300或小于30时， 则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍 数计算。（见下表例） 稀释液及菌落数 菌落总数 cfu/g(mL) 报告方式 cfu/g(mL) 10-110-210-3 多不可计3051230500 31000或 3.1104 菌落数的报告 1.菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则 修约，采取两位有效数字报告。 2.大于或等于100时，第三位数字采用“四舍五 入”原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位

14、数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入” 原则修约后，采用两位有效数字。 3.若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报 告菌落蔓延。 4.若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果 无效。 5.称重取样以CFU/g为单位，液体体积为 CFU/mL。 3培养基及试剂的制备 平板计数琼脂（PCA）培养基 胰蛋白胨5.0g；酵母浸膏2.5g； 葡萄糖1.0g；琼脂15.0g； 蒸馏水 1000mL PH7.00.2 制法：将上述成分加于蒸馏水中，煮沸 溶解，调节PH。分装试管或锥形瓶， 121高压灭菌15min。 磷酸盐缓冲液：按GB/T4789.282003中 3.22规定。 生理盐水 氯化钠 8

15、.5g；蒸馏水 1000mL 制法：氯化钠溶解后，分装，高压灭菌。 75%乙醇 第四章 霉菌和酵母菌的计数 l霉菌和酵母菌广泛分布于自然界，也可作 为食品中正常菌相的一部分。但在某些情况 下，各类食品由于遭受霉菌和酵母菌的污染 ，常常发生霉变，使食品失去色、香、味； 有些霉菌的有毒代谢产物引起各种急性和慢 性中毒，特别是有些霉菌毒素具有强烈的致 癌性。因此霉菌和酵母菌也可作为评价食品 卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母菌计数 来判定食品被污染的程度。 第一节 检验方法 l霉菌和酵母菌计数 检样稀释度及培养 l以无菌操作将检验25g(mL)剪碎放于含有 225mL灭菌生理盐水或其他稀释液灭菌玻璃瓶 内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳 钵内，经充分震荡或研磨做成1:10的均匀稀 释液。固体检样在加入稀释液后，最好置于 均质器中以8000r/min10000r/min的速度处 理1min，做成1:10的均匀稀释液。 l用1.0mL灭菌吸管吸取上述1:10稀释液 1.0mL，沿管壁徐徐注入含有9.0mL灭菌生理 盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端 不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均 匀，做成1:100的稀释液。另取1.0mL灭菌吸 管，按以上操作方法，做10倍递增稀释，如 此每递增稀释一次，即换用1支1.0mL灭菌吸 管。 l根据食品卫生标准要