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1、 目录目录 第一章第一章 样品制备样品制备 2 1.1 一般性原则 2 1.2 样品制备程序 3 1.2.1 培养细胞样品处理方法 3 1.2.2 组织样品处理方法 3 1.2.3文献报道较多的裂解液配方 4 第二章第二章 第一向等电聚焦（第一向等电聚焦（IEF） 7 2.1 IPG胶条的水化和电泳 7 2.1.1 仪器 7 2.1.2 试剂 7 2.1.3 实验步骤 7 2.2 IPG胶条的平衡 9 2.2.1 仪器 10 2.2.2 试剂 10 2.2.3 实验步骤 10 第三章第三章 第二向第二向 SDS 电泳电泳 12 3.1 垂直 SDS-PAGE 12 3.1.1 溶液 12 3.
2、1.2 灌胶步骤 12 3.1.3 电泳步骤 14 第四章第四章 2-DE 胶蛋白质点的检测胶蛋白质点的检测 15 4.1 考马斯亮兰染色 15 4.1.1 经典的考马斯亮兰染色程序 15 4.1.2 Neuhoff胶体考染法 15 4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法 16 4.2 硝酸银染色 16 Appendix I Troubleshooting 18 Appendix II Solutions 23 2DE 分析流程：分析流程： 样品制备（样品制备（Sample preparation） 固相固相 pH 梯度胶条的水化（梯度胶条的水化（IPG strip rehydration）
3、 第一向等电聚焦（第一向等电聚焦（IEF） 第一向胶条的平衡（第一向胶条的平衡（ IPG strip equilibration） 1 第二向第二向 SDS 电泳（电泳（SDS-PAGE） 检测染色（检测染色（Detection/Staining） 第一章第一章 样品制备（样品制备（Sample Preparation） 1.1 一般性原则：一般性原则： 样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影 响 2-DE 结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多 样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽 提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减
4、少对蛋白质的人为修饰；3） 破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状 态。 根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes), 主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea） ；表面活性剂（sufactants） ， 2 也称去垢剂，早期常使用 NP-40、TritonX-100 等非离子去垢剂，近几年 较多的改用如 CHAPS 与 Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂 （reducing agents） ，最常用的是二硫苏糖醇（DTT） ，也有用二硫赤藓 糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入 Tr
5、is-base, 蛋白酶抑制剂（如 EDTA、PMSF or Protease inhibitor cocktails）以及核酸酶。 样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理 组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必 须考虑到去除影响蛋白质可溶性和 2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、 多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过 高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏 IPG 胶条；这样都会造成 2-DE 的 失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。 核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防 止
6、产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的 2D 胶上。脂类和多 糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以 采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。 因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要 求来进行选择。 1.2 样品制备程序：样品制备程序： 1.2.1 培养细胞（培养细胞（culture cell）样品处理方法：）样品处理方法： 培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接 加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋白。裂解缓冲液有多种配方， 本实验室主要采用如下成份： (A) 7M Urea， 2M
7、Thiourea， 4 （w/v） CHAPS， 40mM Tris-Base， 40mM DTT，2 Pharmalyte pH 3-10. 其他常用的裂解缓冲液如下：其他常用的裂解缓冲液如下： (B) 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3-10, 1%(w/v) DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor; (C) 加入 0.3-1% SDS在 95 oC煮样品 5mins，冷却后加入至少 5 倍 3 体积的（A）或（B）裂解液。 总蛋白抽提程序：总蛋白抽提程序： （1） 培养细胞的收集
8、； （2） 用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞 3 次（室温，1000g，各 2min） ； （3） 将细胞分装到 1.5ml Eppendof 管中，吸干残留的 PBS； （4） 加入裂解缓冲液（1.5x106 个细胞大约加入 100L裂解液） ，在室 温振荡 1h，使其充分溶解； （5） 4oC，40,000g，离心 1h； （6） 吸取上清并用Brandford法定量蛋白，然后分装至Eppendof管里保 存在-78oC备用。 1.2.2 组织样品处理方法：组织样品处理方法： 对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用 的程序。 但遵循的原则基本相同。 下面列出一种对植物树叶
9、总蛋白的方法。 三氯醋酸丙酮沉淀法（三氯醋酸丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation）提取植物树叶总 蛋白程序： ）提取植物树叶总 蛋白程序： （1） 在液氮中研碎叶片； （2） 悬浮于含 10三氯醋酸（TCA）和 0.07%-巯基乙醇(可用DTT替 代)的丙酮溶液在20 oC的冰浴； （3） 让蛋白质沉淀过夜然后离心（4oC，40,000g, 1h） ，弃上清； （4） 重悬沉淀浮于含 0.07%-巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液里； （5） 离心（4oC，40,000g, 1h）后真空干燥沉淀； （6） 用（A）或（B）裂解液溶解沉淀，离心（4oC，40,000g, 1h）
10、。 （7） Brandford法定量蛋白，然后分装至Eppendof管里保存在-78oC备 用。 超速离心法：超速离心法： （1）取材； 4 （2）用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每 1g样品加入 0.5ml 裂解液， 使用组织匀浆器匀浆 30 s； （3）组织悬液 15，10 000g 离心 10 min； （4）上清液 4，150 000g 超速离心 45 min； （5）小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清 6 40,000g再次离心 50 min； （6）取离心上清。Bradford法定量，分装后置75保存。 1.2.3 文献报道较多的裂解液配方文献报道较多的裂解液配方 Lys
11、is buffer A (9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Final concentration Amount Urea (FW 60.06, Sigma, 99.5%) 9 M 10.8 g CHAPS (FW 614.89, Sigma, 98% 4% (w/v) 0.8 g Ultrapure H2O to 20 ml prepare fresh or store in aliquots at 20 A cocktail of protease inhib
12、itors DTT(FW 154.25, Promega) 1% 13 L/200 L Lysis buffer (15.5stock), -20 Lysis buffer B (7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer C 5 40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O Lysis buffer D (8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base),
13、40 ml) Final concentration Amount Urea (FW 60.06) 8 M 9.6 g CHAPS 4% (w/v) 0.8 g Tris base (FW 121.1) Ultrapure H2O to 20 ml prepare fresh or store in aliquots at 20 A cocktail of protease inhibitors DTT (FW 154.25, Promega) 1% 13 L/200 L Lysis buffer (15.5stock), -20 Lysis buffer E (5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA
