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1、 一、蛋白质(protein)通论 蛋白质是生命活动的 物质基础，它参与了 几乎所有的生命活动 过程 蛋白质存在于所有的 生物细胞中，是构成 生物体最基本的结构 物质和功能物质 （一）蛋白质的化学组成和分类 1、蛋白质的元素组成与糖和脂类不同，除含有C 、H、O外，还有N和少量的S、P。某些蛋白质 还含有其他一些元素，主要是Fe、Cu、Co、 Mn、 Zn等。这些元素在蛋白质中的组成百分 比约为： 碳 50 氢 7 氧 23 氮 16% 硫 0-3 其他 微 量 2、蛋白质的含氮量 蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生 物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量： 蛋白质含量=每克生物样品
2、中含氮的克数 6.25 蛋白中的氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部 分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作 蛋白质的含氮量。 凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即 在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成 无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏 出并为过量硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定再以标 准酸碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量 比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋 白质定量方法。 Degradation: Protein + H2SO4 (NH4)2SO4 + CO2 + SO2 + H2O Liberati
3、on of ammonia: (NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O + 2NH3 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O Titration: (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O (NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O 2NH4Cl+4H3BO3 二、蛋白质的分类按照组成分类 单纯蛋白质：蛋白仅由氨基酸组成，单纯蛋白可根据其物理 性质如溶解度分类：清蛋白、球蛋白、组蛋白等； 缀合蛋白质：除了氨基酸以外，蛋白质上还存在其他化学成 分作为其结构的一部分。其中非蛋白部分称为辅基。缀合蛋 白可根据其辅基进行分类：糖蛋
4、白、脂蛋白、血红素蛋白； 氨基酸残基数=蛋白分子量/110 对不含辅基的简单蛋白而言： 纤维状蛋白球状蛋白 膜蛋白 蛋白质的分类按蛋白形状和溶解度分类： 蛋白质的分类按功能分类： 酶、转运蛋白、调节蛋白、贮存蛋白、受体蛋白、 结构蛋白、运动蛋白等。 肌红蛋白 （一条多肽链+血红素辅基 ） 单体蛋白质 血红蛋白 （4条多肽链+铁原子的环状血红素辅基 ） 寡聚/多聚蛋白质 蛋白质的分类按肽链组成 （二）蛋白质的构象和蛋白质结构的组织层次 蛋白质是相对分子量很大的生物分子， 每一种天然蛋白质都 有自己特有的空间结构或称三维结构，这种三维结构通常被称 为蛋白质的构象。 为了表示蛋白质结构的不同组织层次
5、，一般采用下列术语： Protein的一级结构（primary structure) Protein的二级结构（secondary structure) Protein的三级结构 （tertiary structure) Protein的四级结构（quarternary structure) 一级结构：多肽链氨基酸序列 二级结构：-螺旋和-折叠 三级结构：具有特定走向的三维结构 四级结构：各亚基在空间上的组合 蛋白结构的组织层次 氢键、 离子键 、范德 华力、 疏水作 用 肽键(peptide bond) Amino acid 的连接方式， 实验根据：p163 Amino acid 通过肽键连
6、接起来的化合物称为肽 (peptide) 除了共价肽键，还存在二硫键。 二、多 肽 （一）肽 T-3是C末端，因为其不以Arg(R)、 Lys(K)结尾 C-3与T-1和T-4都重叠 1. 用特异性低的蛋白酶，例如胃蛋白酶， 水解蛋白质成小片段的肽段 2. 对角线电泳样品点在滤纸中央 一向电泳 用过甲酸蒸气断裂二硫键 旋转90度，进行第二向电泳 茚三酮显色 常规肽段在对角线上 含硫磺基丙氨酸肽段偏离对角线 对含有硫磺基丙氨酸肽段进行序列分析 四、蛋白质的氨基酸序列与生物学功能 （一）同源蛋白质的物种差异与生物进化 （1）同源蛋白质：在不同生物中行使相同或相似生物学功能的蛋白 质称同源蛋白质，例
7、如血红蛋白。其氨基酸序列具有明显的相似性， 即同源性。同源蛋白具有一个进化祖先。 （2）同源蛋白质的某些位置的氨基酸残基在已研究过的物种中都是 相同的，这些氨基酸残基成为不变残基；其他在不同物种中变化大的 则称为可变残基。 含有血红素的细胞色素c N 端 C 端 1 Gly 6 Gly 10 Phe 17 Cys 18 His 29 Gly 30 Pro 32 Leu 41 45 Gly 48 Tyr 38 Arg 34 Gly 52 Asn 68 Leu 59 Trp 70 80 Met 82 84 Gly 91 Arg 100 Gly 细胞色素c及其系统进化树： 对40多种物种中的细胞色素
8、C氨基酸序列分析， 其多肽链中28个氨基酸残基在所有分析过的样品 中都是保守的。 第70-80间的保守氨基酸是成串存在。 可变残基可能是填充或者间隔的区域，其变化不 会影响蛋白质的功能； 任两个物种间细胞色素c的氨基酸差异数目越多， 进化上相距越远。 四、蛋白质的氨基酸序列与生物学功能 C protein in Salmonella enterica MSKLVQAYDLAEYEDFINQEQFAGRPLAEYVAEVQRIYCADKRPWVIGYSGGKDSSAVITLVYLALLGLPPEMRSKDVFIVSSDTLVETPVVVDLIKKTMLQIEAGAKRNGLPIT QHAVTPK
9、TNETFWVNLLGKGYPAPTRSFRWCTERMKINPVSDFIKDKVSQFDEVIVVLGSRSSESASRAQVIAKHKIDGSRLARHTTLANAFIYTPIDTWDVEDVWKLLRGAF RYAPEDIDEWESPWGGNNRPLWTLYMDSSAQGECPLVIDESTPSCGNSRFGCWTCTVVTKDKAMESLIKNGEEWMSPLLKYRDLLAFTTDPANKDTYRNYKRRTGKVSYQY AKDGEDRSAERKHVPGPYWLKYRQQWLKDLLEIERDLNAQGHTITLITQPELHAIRQEWLKDPNEPDWHDTLPEIYREVYQ
10、QDLNWVVDDQSRFDASDADLLAQITQGF DVVPEMVMKLIELETSMEGLSRRQGIFDKLGTILKQDWGSLEEIQQQQATLQKRNDRDIHQDEVEKLEAELQTLQRRIIDAGESSVLIDEENERAH 1. 蛋白保守结构域鉴定 2. 寻找Database中同源性蛋白 3. 基于氨基酸序列的进化分析 缩合剂 除去 保护基 (保护基) (保护基) 保护基条件：接肽的时候起保护作用，接肽完成后又容易除去，不引起肽链断裂 肽和蛋白质的人工合成 氨基保护基 Y： 羧基保护基 Z： 叔丁氧甲酰基 苄氧甲酰基 对甲苯磺酰基 叔丁酯 苄酯 钠盐、钾盐、三乙胺盐
11、等 1963年，R.B.Merrifield创立了将氨基酸的C末端固定在不溶 性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、 合成蛋白质的固相合成法。在固相法中，每步反应后只需 简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的。克服了液相合成法 中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了 基础。为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖。固相法 得到了很大发展，除了Merrifield所建立的Boc法(Boc：叔丁 氧羰基)之外，又发展了Fmoc固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基） 多肽的固相合成 Fmoc保护氨基酸 挂接 弱碱性下 去保护 第二个氨基酸羧基被N,N- 二环己基碳二亚胺活化 NH3+对活化羧基 攻击形成肽键 多 次 循 环 ， 延 长 肽 链 去保护&把肽链从 树脂上释放 氯甲基聚苯乙烯树脂 P192-193 沉淀
