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1、1.2 基因工程的基本操作程序 * * 1 1 原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子终止子 编码区： 能转录，编码蛋白质 非编码区 ： 不编码蛋白质,能调控遗传信息表达 * * 2 2 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 启动子终止子 编码区上游 编码区下游 内含子 外显子 与RNA聚合酶 结合位点 编码区： 非编码区 ： 外显子 ： 内含子 ： 能编码蛋白质的序列 不能编码蛋白质的序列 * * 3 3 非编码区非编码区编码区 RNA聚合酶 结合位点 外显子内含子终止子 启动子 原 核 真 核 基因的结构 * * 4
2、 4 原核细胞真核细胞 不同点 编码区是 _的 编码区是间隔的 、_的 相同点 都由能够编码蛋白质的_和具 有调控作用的_区组成的 原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较 思思 考考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核 细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？ 连续连续不连续 不连续 编码区编码区 非编码非编码 * * 5 5 山西省孝义市第二中学山西省孝义市第二中学 基因工程的基本操作程序 vv目的基因的获取目的基因的获取 vv基因表达载体的构建基因表达载体的构建 vv将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞
3、 操作过程操作过程 vv目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 * * 6 6 * * 7 7 目的基因主要是指_ 编码蛋白质的基因 目的基因的获取目的基因的获取 供体生物细胞 取出DNA 用限制酶剪 去多余部分 目的基因 即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来 目前被广泛提取使 用的目的基因有：苏 云金杆菌抗虫基因、 植物抗病基因（抗病（抗病 毒、抗细菌毒、抗细菌) )、人胰岛 素基因等。也可以是 一些具有调控作用的 因子 * * 8 8 获得目的基因的方法获得目的基因的方法 l 从基因文库中获取目的基因 1.什么是基因文库？ 2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？ 种类： 基因组
4、文库： 部分基因文库： (如cDNA文库) 基因的核苷酸序列等 l 利用PCR技术扩增目的基因 l 人工合成 含有一种生物的全部基因 含有一种生物的部分基因 根据基因的有关信息：如基因的转录产物mRNA 未知序列未知序列 基因较小已知序列基因较小已知序列 已知序列已知序列 * * 9 9 1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。 核心 3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 (二)基因表达载体的构建 * * 101
5、0 质粒DNA分子 限制酶处理 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 核心 同一种 (二)基因表达载体的构建 4.过程 : * * 1111 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的 过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体 质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基 因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗 虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株 还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫 基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入 棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 资资
6、 料料: : * * 1212 基因表达载体的组成：基因表达载体的组成： 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存 在，并且可以遗传给下一代，同时使目 的基因能够表达和发挥作用。 a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 * * 1313 (三)将目的基因导入受体细胞 常用的受体细胞：常用的受体细胞： 动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。 将目的基因导入受体细胞的原理：将目的基因导入受体细胞的原理： 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 转化目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程 受体细胞 稳定表
7、达 * * 1414 方法 导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞吸收 DNA分子 (三)将目的基因导入受体细胞 * * 1515 (四)目的基因的检测与鉴定检查是否成功 检测 鉴定 检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 方法 方法 方法 DNA分子杂交 分子杂交 抗原-抗体杂交 * * 1616 直接分离法: 用限制酶切成许多片断用限制酶切成许多片断 2. 构建基因文库 将含有某种生物不同基因将含有某种生物不同基因 的
8、许多的许多DNADNA片断，导入受片断，导入受 体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物 的不同基因，称为基因文库。的不同基因，称为基因文库。 * * 1717 直接分离法： 供体细胞中的DNA 许多DNA片段 运载体 限制酶 分别与 载体连接 受体细胞 分别 导入 2. 构建基因文库 * * 1818 mRNA 反转录 cDNA (互补DNA） DNA聚合酶 双链DNA 反转录法： 2. 构建基因文库 * * 1919 cDNA合成过程 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补 的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。 第二步，核酸
9、酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链 降解，使之变成单链的DNA。 第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下 合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。 * * 2020 基因组文库：一般针对原核生物的基因，因为基因少基因组文库：一般针对原核生物的基因，因为基因少 部分基因文库：一般针对真核生物的基因，如部分基因文库：一般针对真核生物的基因，如cDNAcDNA文库文库 文库类型cDNA文库基因组文库 文库大小小大 基因中启动子无有 基因中内含子无有 基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因 物种之间的基 因交流 可以部分基因可以 说明基因文库的组建过程就包含基因工程的基本
10、操作 步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作 简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性. 基因文库的构建方法基因文库的构建方法 * * 2121 依据：目的基因的有关信息。 如：根据 基因的核苷酸序列 基因的功能、基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因的表达产物蛋白质等特性。 3如何从基因文库中得到所需要的基因？ * * 2222 利用PCR技术扩增目的基因 原理: DNA双链复制 前提: 要有一段已知 目的基因的脱 氧核苷酸序列 ，以便合成引 物。 * * 2323 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术 条件：_、 _、_ 、 _.前提条件： 原理：_ 方
11、式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数） 结果： 选修1 P60 聚合酶链式反应 体外特定DNA片段 DNA双链复制 已知基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸一对引物 DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 利用PCR技术扩增目的基因 * * 2424 过程： a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_ b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。 氢键单链DNA 双链 DNA链 * * 2525 * * 26
12、26 利用PCR技术扩增目的基因 * * 2727山西省孝义市第二中学山西省孝义市第二中学 PCR技术扩增过程 a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下， 断裂，形成_ b、复性（55-60）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用 下，从引物的5端3端延伸，合成与 模板互补的_。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 * * 2828 PCR技术DNA复制 过程 DNA变性（9095）退火（ 复性5560）子链延伸（ 7075）重复循环 DNA复制起始，RNA引物形成 DNA片段生成RNA引物水解 完整的DNA分子形成 相同
13、点 原则碱基互补配对 条件模板、原料（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）、能量、酶、引物等 不同 点 解旋方 式 氢键在高温下断 裂，双链全部解 开 解旋酶催化氢键逐步断裂 场所体外主要在细胞核中 引物DNARNA 酶 热稳定DNA聚合酶 （Taq酶） 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 结果 在短时间内形成 大量的DNA片段 形成完整的DNA分子 利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 * * 2929 目的基因的目的基因的mRNAmRNA 单链单链DNA DNA (cDNA(cDNA） 双链双链DNADNA ( (即目的基因即目的基因) ) 反转录反转录 合成合成 1
14、 1）反转录法：）反转录法： 以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信 使使RNARNA为模板，反转录成互为模板，反转录成互 补的单链补的单链DNADNA，然后在酶的，然后在酶的 作用下合成双链作用下合成双链DNADNA，从而，从而 获得所需的基因。获得所需的基因。 蛋白质蛋白质 的氨基的氨基 酸序列酸序列 mRNAmRNA 的核苷的核苷 酸序列酸序列 结构基因结构基因 的核苷酸的核苷酸 序列序列 目的目的 基因基因 推测推测 推测推测化学化学 合成合成 2 2）根据已知的氨基酸序列合成）根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ： * * 3030 2.微生物作受体细胞原因： 将目的基因导入
15、微生物细胞 3.转化方法： 大肠杆菌 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 处理细胞细胞 表达载体与感受态细胞混合 _细 胞吸收DNA分子。 Ca2+ 感受态 感受态 1.常用菌： * * 3131 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达 1.农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物 。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上 2. 转 化 * * 3232 * * n n 如果显示出杂交带，就表明待测样品含有如果显示出杂交带，就表明待测样品含有 目的基因或目的基因已经转录。目的基因或目的基因已经转录。 * * 3434
