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1、基因工程原理 Principle of Gene Engineering 第五章 基因工程原理 第五章 DNA重组 （限制 性内切 酶） 运输工 具 基因克 隆载体 目的基 因的制 备 目的基 因导入 受体细 胞 外源基 因的表 达 基因工 程的应 用 第五章 重组基因导入受体细胞 第一节 受体细胞 受体细胞（receptor cell），又称宿主细胞或寄主细胞，是能 够摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。受体细胞的选择应 符合以下原则： 便于重组DNA分子的导入 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中 便于重组体的筛选 遗传稳定性高 安全性高 内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低 遗传密码无明显
2、偏倚性 具有较好的转移后加工机制 1.原核受体细胞 较为理想的受体细胞： 大部分没有细胞壁，便于外源 DNA进入 没有核膜，染色体DNA没有固定 结合的蛋白质 基因组简单，不含线粒体、质体 多为单细胞，容易获得一致性材 料，易于扩大培养或发酵生长 常用细菌：大肠杆菌。 大肠杆菌。 特点：G-,单个细胞，0.5 m * (13) m，周身鞭毛、 能运动、无芽孢 。 例：胰岛素、生长素、干扰素、RE 优点：完善成熟的受体系统。 缺点：毒素等，折叠加工问题 酵母菌表达系统的优势： 结构最为简单的真核生物之一，基因 表达调控机理比较清楚，遗传操作简 单 培养简单 遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵 生长
3、 安全性高，无致病性，不会对外界环 境造成污染 具有较好的转译后加工机制，便于真 核生物表达 2.酵母受体细胞 3. 植物受体细胞 优点：真核细胞、细胞的全能性。 4. 动物细胞 受体细胞包括：小鼠BHK细胞、中 国仓鼠卵巢细胞CHO，猴肾细胞 等 受体动物：鼠、牛、羊、鱼等 第二节 重组基因导入受体细胞 一、重组基因导入原核受体细胞 接受DNA片段 转化（transformation）重组质粒DNA分子 进入受体细胞，并在受体细胞稳定维持和表 达的过程，转化后的受体菌，称转化子。 （一）转化 1928年英国学者FGriffth在肺炎双球菌中发现的，证 明了遗传的物质基础是DNA。 转 化 率
4、 转 化 子 D N A 分 子 数 转 化 子 细 胞 数 Ca2+诱导大肠杆菌转化法 对数生长后期的菌体 5x107个/毫升 冰浴10分钟 含CaCl2缓冲液 15分钟 含CaCl2缓 冲液 （1）感受态的制备 （2）DNA分子 转化感受态 细胞 （ 3 ） 筛 选 转 化 子 。 Ca2+： 低温下使磷质层形成液晶结构 ，使膜间核酸酶分离 与DNA结合，抗DNase （二）转导 是指通过噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞将外源DNA 分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。 D突变 E突变 溶源菌培养诱导溶菌生长 45 15min 39 2-3h 收集包装物 噬菌体DNA 噬菌体颗粒转导 包装
5、 （三）转染 是采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，将重组 噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程。 （四）电激穿孔 是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿 孔，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。 1988年，Dower WJ等 参数： 电场强度 电脉冲时间 外源DNA浓度 当50%70%菌体细胞死亡时，转化率最高 （五）三亲本杂交（triparental mating） 三亲本杂交结合转化法是基于非接合型质粒的迁移作用而建 立的一种DNA转化方法。 二、重组基因导入植物受体细胞 （一）土壤农杆菌介导的Ti质粒转化 外植体：植物组织培养中作为离体培养材 料的器官
6、或组织的片段。在继代培养时，将培养的组织切 段移入新的培养基时，这种切段也称外植体。 将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆 菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后 通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 （Vir 区） （Con区） 长度25kb，占Ti质粒1/10 主要功能是转移DNA，随机插入植 物染色体中。 天然的质粒克隆载体。 含有2类基因： （1）编码冠瘿碱合成酶（ocs、nos） 及分解代谢的基因。 （2）诱发肿瘤基因（Onc） V ir区：激活T-DNA转 移，使农杆菌表现出 毒性。占Ti质粒1/3 。 C o n 区 调 控 T i 质 粒 在 农 杆
7、 菌 之 间 的 转 移 ， 含 有 与 细 菌 间 接 合 转 移 的 有 关 基 因 t r a 。 O r i 区 复 制 起 始 区 。 限制性酶 切开 外源基因 Ti质粒载体 （1）叶盘法转化植物细胞 （2）整体植株接种转化法 人为地在整体植株上造 成创伤部位，然后把农杆菌 接种在创伤表面，使农杆菌 按照天然的感染过程在植株 体内进行侵染。获得转化的 植物愈伤组织或转基因植株 。 （3）原生质体共培养转化法 原生质体共培养转化法 是以原生质体作为受体细胞 ，通过将根癌农杆菌与原生 质体作短暂的共培养，然后 洗涤除去残留的根癌农杆菌 后，置于含抗生素的选择培 养基上筛选出转化细胞，进
8、而再生成植株。 （4）悬浮细胞共培养转化法 与原生质体共培养转化法相似 （二）植物病毒介导基因转移 植 物病毒 D NA病毒20% R NA病毒80% 花椰菜花叶病毒： 双链DNA病毒 （三）化学诱导DNA直接转化 （1）多聚物介导 法 聚 乙二醇 多 聚赖氨酸 多 聚鸟苷酸 （2）脂质体介导 基因转化 脂质体 （四）物理方法介导DNA直接转化 （1）基因枪转化 （2）超声波介导 转化 （3）激光微束穿 孔转化 （4）显微注射 三、重组基因导入动物受体细胞 （一）转染法 （二）脂质体介导转化 （三）动物病毒介导转导法 第三节 重组子筛选 只有少数受体细胞能被导入重组DNA分 子 例：大肠杆菌
9、108个大肠杆菌，转化效率10-6 只有100个细胞被 转化 克隆子的筛选：经过各种方法将外源 DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为 克隆子的筛选（Screening）或选择(Selection)。 转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在 的受体细胞。 重组子：含有重组DNA分子的转化子。如 果重组子含有外源目的基因，又称为阳性克隆子或期 望重组子。 一、遗传表型直接筛选 （一）利用载体选择性标记筛选转化子 1.抗药性标 2.插入失活筛选 3.插入表达筛选 4.互补法（蓝白斑筛选法） （二） 利用报告基因筛选植物转化细胞 （三） 利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 （四）
10、 营养缺陷型检测法 （五） 形成噬菌斑筛选法 二、依赖于重组子结构特征分析筛选 三、核酸杂交分析 （一）分子探针：放射性探针、非放射性探针、 标记探针的方法 （二）核酸探针杂交分析 四、免疫化学分析检测 （一） 抗体检测法 （二） 免疫沉淀测定法（Immunoprecipitation, IP ） （三） 转译筛选法 五、PCR筛选法 一、遗传表型直接筛选 （一）利用载体选择性标记筛选转化子 1. 抗药性标记 氨 苄青霉素 氯 霉素 卡 那霉素 四 环素 链 霉素 2. 插入失活筛选 3. 插入表达筛选 载体的选择性标记基因前链接一段附调控序列，插入式祸福调控序列后，其 下游的筛选标记基因才能
11、表达 。 IPTG：异丙基-D-硫代半乳糖苷 4. 互补法（蓝白斑筛选法） 乳糖操纵子： IPTG -互补：是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵 基因区段的 -半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。 IPTG：异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷 显色剂：X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半 乳糖苷，在-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。 （二） 利用报告基因筛选植物转化细胞 （1）新霉素磷酸转移酶（NPT ）基因 （2）潮霉素磷酸转移酶（HPT ）基因 （3）氯霉素乙酰基转移酶（ CAT）基因 （4）葡萄糖苷酶（GUS） 基因 （5）荧光素酶（LUC）基因 （6）
12、抗除草剂bar基因：抗草 丁膦 （7）冠瘿碱合成酶基因 报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测 的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基 因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它 目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来 标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 荧光素酶（LUC）基因 转入了萤火虫的荧光素酶基因能发光的烟草 (1) 萤光素 + ATP 萤光素化腺苷酸（luciferyl adenylate） + PPi (2)萤光素化腺苷酸 + O2 氧萤光素 + AMP + 光 机理： GFP：绿色
13、荧光蛋白 1. 日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所） 2. 美国科学家马丁查尔菲（哥伦比亚大学） 3. 钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校） 2008年诺贝尔化学奖： GFP标记的微管 将绿黄红荧光蛋白质植入鱼的DNA分子结构中 稳定表达表达GFP的CHO细胞GFP转基因小鼠 （三） 利用遗传选择标记筛选哺乳动物转 基因细胞 （1）胸苷激酶（TK）基因： （2）二氢叶酸还原酶（DHFR）基因 （3）黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（ XGPRT）基因： 胸苷（T）转换 成TMP的基 因 催化二氢叶酸 还原成四 氢叶酸 催化GMP生成 （四） 营养缺陷型检测法 （五） 形成噬菌斑筛选法 二、
14、依赖于重组子结构特征分析筛选 （一） 快速裂解菌落鉴定分子大小 ：琼脂糖电泳，分析DNA分子大小 （二） 限制性核酸内切酶酶解分析 ：DNA酶切图谱 （三）核酸杂交分析 三、核酸杂交分析 基本原理：具有一定互补的两条核酸(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离 子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异地复性形成双链。 核酸杂交：两种不同来源单链DNA或RNA相互配对的过程。 分子杂交：生物大分子之间通过相互作用结合在一起：核酸之间通过碱基 互补配对；蛋白质之间通过抗原、抗体反应；核酸、蛋白质之间通过疏水 作用，氢键进行相互作用。 1968年华盛顿卡内基学院 Roy Britten等 常见的分
15、子杂交： Southern blotting： DNA， DNA/RNA Northern blotting： RNA， DNA/RNA Dot/slot blotting（斑点/狭缝杂交） in situ hybridization：组织原位杂交 Western blotting：蛋白质/抗原、抗体 待测分子探针 （一） 分子探针(Molecular probe)：是指具有同 特异性目标分子产生很强的相互作用并可对其相互作用的产物进 行有效检测的DNA分子、RNA分子和蛋白质。 1. 放射性探针：32P、3H、35S、14C、125I 2. 非放射性探针 （1） 生物素（biotin）标记探针：生物素与dUTP中 尿嘧啶的5位C相连，在聚合酶作用参入DNA dUTP Biotin (维生素H， VH) 连接臂 （藻红素 ） （链霉亲和素 ） （生物素 ） （2） 地高辛标记探针：地高辛与UTP中 尿嘧啶的C5相连 dUTP 连接臂 地高辛 地高辛：异羟基洋地黄毒苷，强心素，拉诺辛，Cardiox，Cardoxin，Cedoxin （3） 荧光素标记探针：用荧光素标记核 酸、抗生物素蛋白或抗地高辛抗体。 荧光物质异硫氰酸荧光素 （黄绿色） 罗丹
