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1、 第九章 蛋白质组学的研究方法和进展 背 景 基因数量有限性和基因结构的相对稳定性 vs 生命现象的复杂性和多变性 从genomic到proteome n对蛋白质的数量、结构、性质、相互关 系和生物学功能进行全面深入的研究已 成为生命科学研究的迫切需要和重要任 务。 第一节 蛋白质组学的概念及其发展史 第二节 蛋白质组学研究方法概述 第三节 蛋白质组学在疾病研究中的应 用 主要内容 第一节 蛋白质组学的概念及其发展 史 n蛋白质组是澳大利亚学者Williams和 Wilkins于1994年首先提出,源于蛋白 质(protein)与基因组(genome)两 个词的杂合,意指proteins ex
2、pressed by a genome,即“一个细胞或一个组 织基因组所表达的全部蛋白质”。 一、蛋白质组学的概念 n对应于基因组的所有蛋白质构成的 整体,不是局限于一个或几个蛋白 质。 n同一基因组在不同细胞、不同组织 中的表达情况各不相同 。 n在空间和时间上动态变化着的整体 。 蛋白质组是: 蛋白质组学(proteomics) 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一 门新兴科学,其目的是从整体的角度分析 细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达 水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互 作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命 活动规律。 主要研究内容 了解某种特定的细胞、组 织或器官制造的蛋白质种类
3、; 明确各种蛋白质分子是如 何形成类似于电路的网络的; 描绘蛋白质的精确三维结构,揭 示其结构上的关键部位,如与药物结 合并且决定其活性的部位。 n研究对象 n基础技术 n研究层次 功能蛋白质组学 (functional proteomics)的提出 n功能蛋白质组:细胞在一定阶段或与某 一生理现象相关的所有蛋白质。 n介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研 究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质 组学之间。 n从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚 群体。 n将多个亚群体组合起来,逐步描绘出接 近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质 组图谱。 二、蛋白质组学的产生与发展 背 景 基因组时代 后基因组时代
4、研究重点的转移及其标志 功能基因组学的主要任务 mRNA水平的基因表达研究取得进 展,但mRNA与蛋白质间的相关系 数仅为0.40.5 蛋白质自身特点难以从DNA和 mRNA水平得到解答 进 展 各国政府支持,国际著名研究和商业机构 加盟: 1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白 质组研究中心(Australia Proteome Analysis Facility,APAF) 美国国立癌症研究院(NCI)投资1 000万 美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋 白质组数据库。 NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不 同阶段的蛋白质组数据库。 英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成 或即将完
5、成全基因组测序的生物体进行蛋 白质组研究。 Celera公司投资上亿美元独自启动了全 面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体 液中的蛋白质及其异构体,构建新一代 的蛋白质表达数据库的工作。 1997年召开了第一次国际“蛋白质组学 ”会议 1998年在美国旧金山召开了第二届国 际蛋白质组学会议 1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋 白质组会议 我国也于1998年启动了蛋白质组学 研究,在中科院上海生物化学研究所 举办了两次全国性的蛋白质组学研讨 会 2003成立了中国人类蛋白质组 组织(CHHUPO),并分别于2003 年9月、2004年8月以及2005年8月 召开了中国蛋白质组学首届、第二届 及第
6、三届学术大会,2004年10月在 中国北京召开了第三届国际蛋白质组 学会议。 n 科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973” 计划项目和“863”计划项目;国家自然科学基金 委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。 n我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组 研究方面取得了较大的进展。 第二节 蛋白质组学研究方法概述 蛋白质组研究更为复杂和困难: 蛋白质数目大大超过基因数目。 蛋白质随时间和空间而变化。 发展高通量、高灵敏度、高准 确性的研究技术平台是现在乃至相 当一段时间内蛋白质组学研究中的 主要任务。 当前主要任务 一、蛋白质组表达模式的 研究方法 n研究蛋白质组的组成成分 n支撑技术主
7、要有双向凝胶电泳 、以质谱为代表的蛋白质鉴定 技术及生物信息学分析。 蛋白质组表达模式( expression profile): (一)蛋白质组研究中的样品制备 n通常可采用细胞或组织中的全蛋白 质组分进行蛋白质组分析。 n也可以进行样品预分级,即将细胞 或组织中的全体蛋白质分成不同部 分,分别进行研究。 样品预分级的主要方法 n蛋白质溶解性:可溶性蛋白、非溶性 蛋白等 n蛋白质定位:膜蛋白、核蛋白等 n蛋白质细胞器定位:线粒体、高尔基 体、叶绿体等 样品预分级主要作用在于 提高低丰度蛋白质的上样量 和检测灵敏度。 组织水平上的蛋白质组样品制备 临床样本都是各种细胞或组 织混杂,而且状态不一
8、,如肿瘤中 癌变的上皮类细胞总是与血管、基 质细胞等混杂。 激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM) 可直接在显微镜下从组织切片 中精确分离特定的细胞或细胞群。 (二)蛋白质组研究中的样品分离 n双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis,2-DE):利用蛋 白质的等电点和分子量,结合凝胶 化学特性,分离各种蛋白质的方法 。 原 理 第一向在高压电场下对蛋白质进 行等电聚焦(IEF), 再在第一向垂直方 向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS-PAGE)。 1975年首先由OFarrell等创立 。 特
9、点 n可分离10100 kD分子量的蛋白 质 n高灵敏度和高分辨率 n便于计算机进行图像分析处理 n与质谱分析匹配 第一向IEF电泳 n传统OFarrell系统双向电泳的缺陷 。 nBjellgvist等发展并完善了固相pH 梯度等电聚焦技术,Grg等成功地 将之应用于双向电泳。 优点 固相pH梯度等电聚焦的优点 克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点 。 稳定的可以随意精确设定的pH梯度。 尤其可在较窄的pH范围内进行第二 轮分析,大大提高了分辨率及重复性。 第二向SDS-PAGE电泳 垂直板电泳 水平超薄胶电泳 2-DE技术的缺点 极酸、极碱性蛋白质,疏水性蛋白质 ,极大蛋白质、极小蛋白质以及
10、低丰 度蛋白质用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力,难于与质 谱联用实现自动化。 新型非凝胶技术 液相色谱法 liquid chromatography,LC 毛细管电泳 capillary electrophoresis,CE n液质联用技术(LC-MS/MS) 蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以 代替2-DE的分离,然后进入MS系统获得肽 段分子量,再通过串联MS技术,得到部分 序列信息,最后通过计算机联网查询、鉴定 蛋白质。 根据蛋白质带电性及疏水性不同 ,用MS分离多肽复合物。 n多维色谱技术(LC/LC-MS/MS) n多维蛋白质鉴定技术 (multidimensiona
11、l protein identification technology) (三)蛋白质组研究中的样品分析鉴定 传统方法:蛋白质微量测序 氨基酸组成分析 新型蛋白质鉴定技术 质谱(MS)法 基本原理:样品分子离子化后, 根据离子间质荷比(m/z)的差 异来分离并确定样品的分子量。 “软电离”的特点 n分子电离时保留整个分子的完整性, 不会形成碎片离子。 n灵敏度高、快速、能同时提供样品的 精确分子量和结构信息、既可定性又 可定量、并能有效地与各种色谱联用 来分析复杂体系。 n基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱 (matrix-assisted laser desorption/ionizatio
12、n time of flight mass spectrometry,MALDI- TOF MS) n电喷雾质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS) 主要质谱类型 鉴定和注释蛋白质的路线 n通过肽质谱指纹图(peptide mass fingerprinting,PMF)和数据库搜寻 匹配 n通过测出样品中部分肽段二级质谱信息 或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配 目 录 仪 器 nMALDI-TOF质谱仪:灵敏度 高(可达fmol),分析速度快 ,谱图简单易于解析以及受缓 冲液、盐份的干扰小 肽质谱指纹图在数据库中匹配 不成功的可
13、能原因 n 样品量太少,PMF图信噪比太低,输 入库中搜寻的数据质量不好。 n2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非 单一蛋白质,所获PMF图实际上是两 个以上蛋白质的混合图。 n 操作中角蛋白或其他蛋白质的污染 n蛋白质发生了较多的转译后修饰,数 据库中未有记载 n所用胰蛋白酶质量不够好,蛋白酶自 酶解片段多 n未知的新蛋白质 n数据库规模太小 续: 组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱(MALDI- TOF/TOF) 傅里叶转换回旋共振质谱(FTMS) 表面增强激光解吸/电离飞行时间质 谱(SELDI-TOF-MS) 联合技术精确鉴定蛋白质 (四)蛋白质组学研究的生物信息学 生
14、物信息学是蛋白质组学研究 的一个不可缺少的部分。 构建和分析双向凝胶电泳图谱 数据库的搜索与构建 应 用 蛋白质组数据库是蛋白质组 研究水平的标志和基础 n瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上 最大、种类最多的蛋白质组数据库。 n目前应用最普遍的数据库是NRDB 和 dbEST数据库。 dbEST数据库 由美国国家生物技术信息中心(NCBI)和 欧洲生物信息学研究所(EBI)共同编辑, 包括许多生物体的表达序列标签(EST) 肽序列标签(PST)或部分序列信 息最适合查寻 概念:把一个基因组表达的全部 蛋白质或一个复杂体系中所有的 蛋白质进行精确的定量和鉴定。 (五)定量蛋白质组学研究 低
15、丰度蛋白质检测困难 蛋白质表达量差异很小,如在50% 以下时,精确定量成为瓶颈 蛋白质表达的瞬时变化 蛋白质定量的难点 1基于双向凝胶电泳的定量 蛋白质组研究策略 双向凝胶电泳(2-DE)是目前唯一能分离 展示大量蛋白质并进行蛋白质定量分析的 一种方法。 荧光差异显示双向电泳(F-2D-DIGE) 2基于生物质谱的定量蛋白 质组研究策略 原理:对于具有相同离子化能力的蛋 白质或多肽,可以通过比较质谱峰的 强度(或峰面积)得到待比较蛋白质 的相对量。 二、蛋白质组功能模式的 研究方法 n揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互 协调的关系,并深入了解蛋白质的结构 与功能的相互关系,以及基因结构与蛋 白质结构功能的关系。 主要研究目标 (一)蛋白质翻译后修饰的研究 翻译后修饰 糖基化 乙酰化 甲基化 羧基化 二硫键 n修饰肽的检测的高灵敏