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1、 第八章 菌种的保藏 第一节节 菌种的衰退和复壮 一、菌种的衰退 二、菌种的复壮 第二节节 菌种的保藏 一、菌种保藏的目的 二、菌种保藏的原理 三、菌种保藏的方法 l 性状稳稳定的菌种是微生物工作最 重要的基本要求，否则则生产产或科研 都无法正常进进行。 l 影响微生物菌种稳稳定性的因素： a）变变异；b）污污染；c）死亡 第一第一节节节节 菌种的衰退和复壮菌种的衰退和复壮 在微生物的基础础研究和应应用研究中， 选选育一株理想的菌株是一件艰艰苦的工 作，而欲使菌种始终终保持优优良性状的 遗传稳遗传稳 定性，便于长长期使用，还还需要 做很多日常的工作。实际实际 上，由于各 种各样样的原因，要使菌
2、种永远远不变变是 不可能的，菌种衰退是一种潜在的威胁胁 。只有掌握了菌种衰退的某些规规律，才 能采取相应应的措施，尽量减少菌种的衰 退或使已衰退的菌种得以复壮。 一、菌种的衰退一、菌种的衰退 菌种衰退（degeneration）是指由于自 发发突变变的结结果，而使某物种原有的一系 列生物学性状发发生量变变或质变质变 的现现象。 纯纯菌种 自发发突变变 突变变个体 传传代增殖 原始个体 不纯纯菌种衰退菌种 （一）菌种衰退的现现象 l 菌落和细细胞形态态改变变 l 生长长速度缓缓慢，产孢产孢 子越来越少 l 代谢产谢产 物生产产能力下降，即出现负现负 突 变变 l 致病菌对对宿主侵染能力下降 l
3、对对外界不良条件的抵抗能力下降等 （二）菌种衰退的原因 l 基因突变变主要原因 1、有关基因发发生负负突变导变导 致菌种衰退 2、表型延迟迟造成菌种衰退 3、质质粒脱落导导致菌种衰退 l 连续传连续传 代加速衰退 l 不适宜的培养和保藏条件加速衰退 （三）菌种衰退的防止 l 控制传传代次数 l 创创造良好的培养条件 l 利用不易衰退的细细胞移种传传代 l 采用有效的菌种保藏方法 l 讲讲究菌种选选育技术术 l 定期进进行分离纯纯化 二、菌种的复壮二、菌种的复壮 n 狭义义的复壮消极的措施 是指在菌种已经发经发 生衰退的情况下，通过纯过纯 种分离和测测定典型性状、生产产性能等指标标，从已 衰退的
4、群体中筛选筛选 出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有性状的相应应措施。 n 广义义的复壮积积极的措施 是指在菌种的典型特征或生产产性状尚未衰 退前，就经经常有意识识地采取纯纯种分离和生产产 性状测测定工作，以期从中选择选择 到自发发的正突 变变个体。 菌种复壮的主要方法菌种复壮的主要方法 纯纯种分离法 菌落纯纯（“菌种纯纯”） 细细胞纯纯（“菌株纯纯”） 通过纯过纯 种分离,可将衰退菌种细细胞群体中 一部分仍保持原有典型性状的单细单细 胞分离出 来,经扩经扩 大培养,就可恢复原菌株的典型性状 。 宿主体内复壮法 对对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过过接 种到相应应昆虫或动动植物宿主体内
5、来提高菌株的 毒性。 淘汰法 将衰退菌种进进行一定的处处理（如药药 物、低温、高温等），往往可以起到淘汰 已衰退个体而达到复壮的目的。 遗传遗传 育种法 把退化的菌种重新进进行遗传遗传 育 种，从中再选选出高产产而不易退化的 稳稳定性较较好的生产产菌种。 第二第二节节节节 菌种的保藏菌种的保藏 菌种是重要的生物资资源，研究和选择选择 良好的菌种保藏方法具有重要的意义义。 一、菌种保藏的目的 n 菌种保藏的重要意义义就在于尽可能保持 其原有性状和活力的稳稳定，确保菌种不死 亡、不变变异、不被污污染，以达到便于研究 、 交换换和使用等诸诸方面的需要。 二、菌种保藏的原理二、菌种保藏的原理 首先应该
6、应该 挑选选典型菌种的优优良纯纯种来进进 行保藏，最好保藏它们们的休眠体，如分生 孢孢子、芽孢孢等。 其次应应人为为地创创造环环境条件（如： 干燥、低温和缺氧），使微生物长长期 处处于代谢谢不活泼泼、生长长繁殖受抑制 的休眠状态态。 尽可能多的采用不同的手段保藏 一些比较较重要的微生物菌株 三、菌种保藏方法三、菌种保藏方法 各种微生物由于遗传遗传 特性不同， 因此适合采用的保藏方法也不一 样样。一种良好的有效保藏方法， 首先应应能保持原菌种的优优良性状 长长期不变变，同时还须时还须 考虑虑方法的 通用性、操作的简简便性和设备设备 的 普及性。 斜面低温保藏法 石蜡油封藏法 砂土管保藏法 麸皮保
7、藏法 甘油悬悬液保藏法 冷冻冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法 （一）斜面低温保藏法（一）斜面低温保藏法常用保藏法常用保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长长完全 后，置于4左右的冰箱中保藏，每隔一定时间时间 （保藏 期）再转转接至新的斜面培养基上，生长长后继续继续 保藏， 如此连续连续 不断。 此法广泛适用于各大类类微生物菌种的短期保藏 此法的主要保藏措施是低温。一般可保存16 个月左右。 优优点是简简便易行，容易推广，存活率高；缺点 是菌株仍有一定程度的代谢谢活动动能力，保藏期 短，传传代次数多，菌种较较容易发发生变变异和被污污 染。 （二）石蜡油封藏法（二）石蜡油
8、封藏法 此法是在无菌条件下，将灭过灭过 菌并已蒸发发掉水分的液体 石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物） 上，石蜡油层层高出斜面顶顶端1cm，使培养物与空气隔绝绝， 加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4冰箱内 保藏。 此法广泛适用于各大类类微生物菌种的中期保藏 不适用于保藏某些能分解烃类烃类 的菌种。 此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保 存12年左右。 （三）砂土管保藏法（三）砂土管保藏法 一种常用的长长期保藏菌种的方法，适用于产孢产孢 子的 微生物及形成芽孢孢的细细菌，对对于一些对对干燥敏感的 细细菌及酵母则则不适用。 n砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营营养物等 诸诸
9、条件，故保藏期较长较长 、效果较较好，且微生物 移接方便，经济简经济简 便。它的保藏期约约110年。 n 该该法是将砂与土分别别洗净净、烘干、过筛过筛 ，按一定比例 分装于小试试管中，砂土的高度约约1cm，121蒸汽灭灭菌1 1.5h，间间歇灭灭菌3次。50烘干后经检查经检查 无误误后备备用 。将待保藏的菌株制成菌悬悬液或孢孢子悬悬液滴入砂土管中 ，放线线菌和霉菌也可直接刮下孢孢子与载载体混匀，而后置 于干燥器中抽真空约约24h，用火焰熔封管口(或用石蜡 封口)，置于干燥器中，在室温或4冰箱内保藏。 （四）麸皮保藏法（四）麸皮保藏法 又称曲法保藏。即以麸皮作载载体，吸附接入的孢孢子，然 后在低
10、温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水 以一定的比例拌匀，装量为试为试 管体积积2/5，湿热灭热灭 菌后 经经 冷却，接入新鲜鲜培养的菌种，适温培养至孢孢子长长成。将 试试管置于盛有氯氯化钙钙等干燥剂剂的干燥器中，于室温下干 燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试试管用火焰熔 封，再保藏，则则效果更好。 此法适用于产孢产孢 子的霉菌和某些放线线菌，保藏 期在1年以上。因操作简单简单 、经济实经济实 惠，工厂 较较 多采用。 （五）甘油（五）甘油悬悬悬悬液保藏法液保藏法 此法是将菌种悬悬浮在甘油蒸馏馏水中，置于低温下 保藏，本法较简较简 便，但需置备备低温冰箱。保藏温 度若采用20，保藏期约
11、为约为 0.51年，而采用 70，保藏期可达10年。 将拟拟保藏菌种对对数期的培养液直接与经经 121蒸汽灭灭菌20min的甘油混合，并使 甘油的终浓终浓 度在1015，再分装于 小离心管中，置低温冰箱中保藏。 基因工程菌常采用本法保藏。 （六）冷（六）冷冻冻冻冻真空干燥保藏法真空干燥保藏法 又称冷冻冻干燥保藏法，简简称冻冻干法。它通常是用保护剂护剂 制备拟备拟 保藏菌种的细细胞悬悬液或孢孢子悬悬液于安瓿管中，再 在低温下快速将含菌样冻结样冻结 ，并减压压抽真空，使水升华华 将样样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块块。并在真空 条件下立即熔封，造成无氧真空环环境，最后置于低温下 ，使微生物处处
12、于休眠状态态，而得以长长期保藏。 n 此法适用于各大类类微生物。 n 此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有 保护剂护剂 ，保藏期一般长长达515年，存活率高 ， 变变异率低，是目前被广泛采用的一种较较理想 的 保藏方法。 n 该该法操作比较烦琐较烦琐 ，技术术要求较较高，且需要 冻冻 干机等设备设备 。 （七）液氮超低温保藏法（七）液氮超低温保藏法 简简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜亚砜 等 作为为保护剂护剂 ，在液氮超低温（196）下保藏的方法 。其主要原理是菌种细细胞从常温过过渡到低温，并在降到 低温之前，使细细胞内的自由水通过细过细 胞膜外渗出来，以 免膜内因自由水凝结
13、结成冰晶而使细细胞损伤损伤 。 此法适用于各种微生物菌种的保藏。 此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂护剂 ，保 藏期一般可达到15年以上，是目前公认认的最有 效的菌种长长期保藏技术术之一。 此法的优优点是操作简简便、高效，且可使用各种 培养形式的微生物进进行保藏。其缺点是需购购置 超低温液氮设备设备 ，且液氮消耗较较多，操作费费 用较较高。 （八）宿主保藏法（八）宿主保藏法 此法适用于专专性活细细胞寄生微生物（如病毒、 立克次氏体等）。 植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合， 冷冻冻或干燥保存。 噬菌体可以经过细经过细 菌培养扩扩大后，与培养基 混合直接保存。 动动物病毒可直接用病毒感染适宜
14、的脏脏器或体 液，然后分装于试试管中密封，低温保存。 在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保 藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为为 简简 便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬悬 液保藏法次之；以冷冻冻真空干燥保藏法和 液氮超低温保藏法最为为复杂杂，但其保藏 效 果最好。应应用时时，可根据实际实际 需要选选用 。 ATCC采用的两种保藏方法的优优点示意图图 ； 云联社 twc08tvu 一轮明亮的圆月，深情地想着千里万里之外的心上人。他从刚能记事的时候想起，一直想到他们临分别的前夜一起坐在这里看月亮的情景 ，想他们说过的每一句话想着，想着，明晃晃的月儿爷爷就慢慢地移动到中天位置了。突然，大壮的心里
15、边猛然抽紧了一下！他不安地跳 了起来，脱口而出：“耿英啊，俺知道你很要强，可你毕竟是一个女娃啊！爹和哥哥能时刻守护在你的身边吗？可别遇上”想到这里，大 壮再也不可能静心地回想往事了。他抬脚快步朝河边走去，心里边开始不断地敲小鼓，自言自语地念叨着：“耿英啊，俺给你做的那把 匕首刀你可随身带了吗？你可要随身带着哇！吓唬人的东西也比没有强！”大壮开始后悔了，刚才在憨叔家院儿里大家一起许愿时，自 己只许了请月儿爷爷保佑耿叔他们父子四人平安发财，保佑耿英心情愉快，不要想他，怎么就忘记了许一个保佑耿英远离歹人，或者让她 不要忘记随身带那把“匕首刀”的愿了呢！原本很美好的心境此刻已经荡然无存了。大壮心烦意乱地在小河边上走来走去，抬头望望中天 的明月，再低头看看在潺潺的河水中忽而浑圆，忽而扭曲，忽而又被撕成了碎片的月儿爷爷的倒影，心里边儿那个焦虑哇一会儿，感觉稍 微好了一些。但无论如何，再也无心看那一轮明月了。唉，苦苦地想这些又有什么用呢！还是回家睡觉去哇，明儿个还得赶着骡车去给憨 叔家收秋呢。大壮无可奈何地长叹一声，垂头丧气地往家里走去了。93第四十九回 艰苦创业起步时|（房东怜惜万般好，日后立足靠自己 ；艰苦创业起步时，酒店献艺为生计。）耿正兄妹三人在景德镇
