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1、DNA遗传标记 特点:1.直接反映基因特征,非推测。 2.基因座位数量多,无论表达与否。 3.多态性程度高,等位基因多,鉴别能力 强。 4.适合于陈旧的样品,检测能力强。 5.灵敏度高,有利于微量样品的检测。 6.易于检测手段的自动化、标准化,重复 性好。逐渐取代了蛋白质水平的检测方 法。 第一部 DNA基础 一、DNA结构与特征 1.DNA分子结构 线性大分子-基本单位为脱氧核苷酸 组成-碱基、脱氧核糖、磷酸 差别-碱基:嘌呤碱腺嘌呤(A)与鸟嘌呤(G) 嘧啶碱胞嘧啶(C)与胸腺嘧啶(T) 结构:碱基+脱氧核糖=脱氧核苷-+磷酸=脱氧核苷酸 2. DNA理化性质 1) DNA的变性 变性(d
2、enaturation):在一定条件下,DNA双链间氢键断 裂,形成单链结构的过程。也称退火(annealing)。 条件:A:温度上升-Tm值(melting temperature) 50%DNA分子解链的温度。 与GC/TA比值有关。1%GC-0.4。 B:碱性升高- 0.5N NaOH-完全解链。 2) DNA的复性 复性(renaturation)撤除变性条件后,变性的单链 DNA 根据碱基互补的原则,恢复成DNA双链的过程。 条件:A:温度降低过低易错配。过高不易复性。 B:高离子强度。 3) DNA分子杂交 杂交(hybridization):来源不同的两条DNA单链根据 碱 基
3、互补的原则,形成双链杂种DNA的过程。 二、基因 1. 基因与基因组 基因(gene):合成有功能的蛋白质多肽链 或RNA所需的全部核苷酸序列 基因组(genome):一个生物体的所有基因。 核基因组:细胞核中23对染色体包含的所有基因 线粒体基因组:线粒体DNA中的所有基因 2. 基因结构 结构基因:能够编码产生蛋白质产物的基因。 外显子(exon):编码序列。 内含子(intron):非编码序列(间隔列)。 如珠蛋白-1700碱基(bp),编码146个氨 基酸,3个外显子,2个内含子。 3. 基因突变 突变(mutation):DNA分子中的核苷酸序列的改变。 1)点突变(point mu
4、tation):单碱基置换。 同义突变(same sense mutation): 简并密码,无 突变效应。 错义突变(missense mutation):新密码子,氨基酸 序列变化,产生突变效应。 无义突变(non- sense mutation):变成终止密码, 合成不完整多肽产生突变效应。 终止密码突变(terminator codon mutation):合 成过长的多肽,产生突变效应。 移码突变(frame-shift mutation):DNA链中插入1 个或几个单碱对,使突变处以下部位密码发生变化,使 合成的氨基酸种类或序列变化,产生突变效应。 2)片段突变:DNA链中小片段单
5、碱序列发生缺失、重复或 重排,产生突变效应。 单碱基突变(图中用黑点示意位置为突变点) 三、DNA多态性的分类 1)长度多态性:等位基因片段长度的个体差 别。由一特定序列,首尾相连串联 重复次数不同产生的个体差别。 可变数目串联重复(variable number of tandem repeat,VNTR) 短串联重复(short tandem repeat,STR) A:产生原因:DNA滑动与同源染色体 不等交换。 B:差别: VNTR STR 重复序列组成 2-7 bp 7-数十bp 重复序列数目 2-10数个 10数个-数百个 鉴别能力 高 极高 优势扩增现象 不明显 极明显 检测灵敏
6、度 极高 稍差 片段总长度 200-500 bp 数千以上bp C:STR的命名: 非编码区-D3S1358 D3 第三号染色体 S 单拷贝(single copy) 1358 VNTR序列的发现序号 编码区内含子-HumHPRTB 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因 ( hypoxanthine phosphoribosyl transferase) 1)序列多态性:DNA片段碱基排列顺序的个体差 别。 单核苷酸多态性 (single ucleotidepolymorphism,SNPs) 原因:碱基的置换、插入、缺失。 特点:多位于非编码区,选择压力。 数量多,1/1000 bp,300万 二态性
7、,2个等位基因,多态性 程度较低。 孤立事件,人类遗传学意义大。 第二部分 DNA的制备 核心与关键 脑肺肌肉肾 6pg/细胞 一、 理想DNA样品的要求 1. 纯度-RNA、蛋白质、多糖、脂类。 2. 完整性-DNA大分子。 3. DNA量。g/指纹图;ng/PCR;pg/PCR 二、 经典DNA提取法 1. 在弱碱和螯合剂的条件下行组织匀浆, 溶解胞、核膜。 2. 去垢剂与蛋白酶消化蛋白,分离DNA。 3. 有机溶剂去除蛋白,萃取DNA。 4. 乙醇与盐类沉淀DNA。 三、 试剂的使用原理 1. 弱碱和螯合剂:Tris-HCl pH8.0,DNA分子稳定。 EDTA(乙二胺四乙酸)-抑制核
8、酸酶。通过螯 合镁离子。 2. 去垢剂与蛋白酶:SDS(十二烷基磺酸钠):增加膜 通透性;促进DNA与蛋白质分解;促使核酸酶 与蛋白质变性。 蛋白酶K:酶解组蛋白。 3. 有机溶剂:酚-变性沉淀蛋白质,组蛋白、蛋白酶等。 PH6.0,需Tris-HCl pH8.0平衡。 氯仿-变性沉淀蛋白质,除酚,水相分离。 异戊醇-除酚,除泡沫。 4. 乙醇与盐类:DNA不溶于乙醇与盐类。 四、 基本步骤 1. 样品处理-分离细胞,低渗盐水或细胞悬浮液。 10mmol/L Tris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml胰 RNA酶,0.5%SDS. 2. 消化-TNE (15mmol/
9、L Tris-HClpH8.0,15mmol/LEDTA, 5mmol/L NaCl)4ml,10%SDS0.45 ml,10mg/ml蛋白 酶K(终浓度100g/ml)混匀,503h,45过夜。 3. DNA提取-等体积饱和酚-等体积饱和酚/氯仿/异戊醇( 25/24/1)-氯仿/异戊醇(24/1)。500r/min,10min. 4. 沉淀DNA-1/10体积3mol/L NaAc,2倍无水乙醇-70% 乙醇。室温挥干。 5. 溶解DNA-适量TE(10mmol/L Tris- HClpH8.0,1mmol/LEDTA,长时间。 五、其他方法 1.Chelex-100提取DNA 基本成分:
10、含有亚氨基二乙酸盐离子的苯乙烯-二乙基 苯共聚物。 基本方法:沉淀细胞;5%试剂200l;560.5h以 上;1008min;剧烈震荡;离心上清。 注意: 离心彻底。 2.硅珠法提取DNA 基本成分:GuSCN(硫氰酸胍,蛋白变性剂)与二氧化 硅(硅珠,核酸吸附剂)。 基本方法:血液(1-4l)TES(100l)SDS (20l)煮沸5min;300lGuSCN溶液 与20l硅珠液保温15 min;离心;离心 加GuSCN溶液;离心加乙醇漂洗; TES5610 min离心取上清。 3.直接煮沸法,10010min 六.注意事项 1. 如消化不完全,可用TNE溶解后再重提。 2. 消化时间宜长不
11、宜短。 3. 操作轻柔。 4. 混匀要充分。 5. 挥干不宜过度。 七.不同生物性检材的DNA制备 1.混合斑二步提取法(精液与阴道液) 原理: 精子细胞膜富含硫醇蛋白,包裹DNA 的鱼精蛋白富含半光氨酸,二硫键丰富,可 抵抗蛋白酶作用。二硫苏糖醇(DTT)可还 原二硫键,使蛋白酶发生作用。 方法: (1)分离细胞成分。 (2)常规消化。 (3)加10%SDS40l,1mol/L DTT16l , 10g/l蛋白酶K4l,37过夜。 (4)常规处理。 八.DNA定量 1.凝胶电泳半定量分析法 标准参照分析。 2.分光光度计分析 原理:核酸于260nm波长为吸收峰,1OD值 为50g/l双链核酸
12、(40g/l单链核 酸),根据OD值可计算DNA含量。蛋白 于280nm波长为吸收峰,260/280比检测 核酸纯度。1.6-1.8 九.DNA纯化 第三部分 聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR)在模板DNA和4种脱氧核苷酸 存在的条件下,由一对特异性引物限 定的靶DNA片段,经DNA聚合酶催 化的体外合成过程。 一、 PCR的基本过程 1.变性(denaturation):在加热的条件下( 94左右),模板DNA配对碱基间氢键断裂, DNA双链变成单链。 2.退火(annealing):在降温的条件下( 55-62),引物与其互补的模板DNA结合形 成杂交双链。 3.延伸(extension):在合适的温度下( 68-72),经DNA聚合酶催化4种脱氧核苷 酸,由引物的3端为起始点,从5向3端延伸 ,合成新的与模板DNA 互补的DNA链。 每反应一个循环,靶DNA片段数量增加一倍 ,并以指数的量堆积,经30余次循环,产物量 可达到2105-7个拷贝。几个循环后扩增产物作 为模板。 二、PCR反应的体系 标准体系为50-100l,常用20l。 DNA模板/DNA聚合酶/一对引物/4种脱 氧核苷酸/缓冲液。 反应条件:954-5min,9