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1、DNA遗传标记 特点：1.直接反映基因特征，非推测。 2.基因座位数量多，无论表达与否。 3.多态性程度高，等位基因多，鉴别能力 强。 4.适合于陈旧的样品，检测能力强。 5.灵敏度高，有利于微量样品的检测。 6.易于检测手段的自动化、标准化，重复 性好。逐渐取代了蛋白质水平的检测方 法。 第一部 DNA基础 一、DNA结构与特征 1.DNA分子结构 线性大分子-基本单位为脱氧核苷酸 组成-碱基、脱氧核糖、磷酸 差别-碱基：嘌呤碱腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G） 嘧啶碱胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T） 结构：碱基+脱氧核糖=脱氧核苷-+磷酸=脱氧核苷酸 2. DNA理化性质 1） DNA的变性 变性（d
2、enaturation）:在一定条件下，DNA双链间氢键断 裂，形成单链结构的过程。也称退火（annealing）。 条件：A：温度上升-Tm值(melting temperature) 50%DNA分子解链的温度。 与GC/TA比值有关。1%GC-0.4。 B：碱性升高- 0.5N NaOH-完全解链。 2） DNA的复性 复性（renaturation）撤除变性条件后，变性的单链 DNA 根据碱基互补的原则，恢复成DNA双链的过程。 条件：A：温度降低过低易错配。过高不易复性。 B：高离子强度。 3） DNA分子杂交 杂交（hybridization）：来源不同的两条DNA单链根据 碱 基
3、互补的原则，形成双链杂种DNA的过程。 二、基因 1. 基因与基因组 基因（gene）：合成有功能的蛋白质多肽链 或RNA所需的全部核苷酸序列 基因组（genome）：一个生物体的所有基因。 核基因组：细胞核中23对染色体包含的所有基因 线粒体基因组：线粒体DNA中的所有基因 2. 基因结构 结构基因：能够编码产生蛋白质产物的基因。 外显子（exon）：编码序列。 内含子(intron)：非编码序列（间隔列）。 如珠蛋白-1700碱基（bp），编码146个氨 基酸，3个外显子，2个内含子。 3. 基因突变 突变（mutation）：DNA分子中的核苷酸序列的改变。 1）点突变（point mu
4、tation）：单碱基置换。 同义突变（same sense mutation）: 简并密码，无 突变效应。 错义突变(missense mutation)：新密码子，氨基酸 序列变化，产生突变效应。 无义突变(non- sense mutation)：变成终止密码， 合成不完整多肽产生突变效应。 终止密码突变（terminator codon mutation)：合 成过长的多肽，产生突变效应。 移码突变（frame-shift mutation)：DNA链中插入1 个或几个单碱对，使突变处以下部位密码发生变化，使 合成的氨基酸种类或序列变化，产生突变效应。 2）片段突变：DNA链中小片段单
5、碱序列发生缺失、重复或 重排，产生突变效应。 单碱基突变(图中用黑点示意位置为突变点) 三、DNA多态性的分类 1）长度多态性：等位基因片段长度的个体差 别。由一特定序列，首尾相连串联 重复次数不同产生的个体差别。 可变数目串联重复（variable number of tandem repeat,VNTR） 短串联重复(short tandem repeat,STR) A：产生原因：DNA滑动与同源染色体 不等交换。 B：差别： VNTR STR 重复序列组成 2-7 bp 7-数十bp 重复序列数目 2-10数个 10数个-数百个 鉴别能力 高 极高 优势扩增现象 不明显 极明显 检测灵敏
6、度 极高 稍差 片段总长度 200-500 bp 数千以上bp C：STR的命名： 非编码区-D3S1358 D3 第三号染色体 S 单拷贝（single copy） 1358 VNTR序列的发现序号 编码区内含子-HumHPRTB 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因 （ hypoxanthine phosphoribosyl transferase） 1）序列多态性：DNA片段碱基排列顺序的个体差 别。 单核苷酸多态性 （single ucleotidepolymorphism,SNPs） 原因：碱基的置换、插入、缺失。 特点：多位于非编码区，选择压力。 数量多，1/1000 bp，300万 二态性
7、，2个等位基因，多态性 程度较低。 孤立事件，人类遗传学意义大。 第二部分 DNA的制备 核心与关键 脑肺肌肉肾 6pg/细胞 一、 理想DNA样品的要求 1. 纯度-RNA、蛋白质、多糖、脂类。 2. 完整性-DNA大分子。 3. DNA量。g/指纹图；ng/PCR；pg/PCR 二、 经典DNA提取法 1. 在弱碱和螯合剂的条件下行组织匀浆， 溶解胞、核膜。 2. 去垢剂与蛋白酶消化蛋白，分离DNA。 3. 有机溶剂去除蛋白，萃取DNA。 4. 乙醇与盐类沉淀DNA。 三、 试剂的使用原理 1. 弱碱和螯合剂：Tris-HCl pH8.0，DNA分子稳定。 EDTA（乙二胺四乙酸）-抑制核
8、酸酶。通过螯 合镁离子。 2. 去垢剂与蛋白酶：SDS（十二烷基磺酸钠）：增加膜 通透性；促进DNA与蛋白质分解；促使核酸酶 与蛋白质变性。 蛋白酶K：酶解组蛋白。 3. 有机溶剂：酚-变性沉淀蛋白质，组蛋白、蛋白酶等。 PH6.0，需Tris-HCl pH8.0平衡。 氯仿-变性沉淀蛋白质，除酚，水相分离。 异戊醇-除酚，除泡沫。 4. 乙醇与盐类：DNA不溶于乙醇与盐类。 四、 基本步骤 1. 样品处理-分离细胞，低渗盐水或细胞悬浮液。 10mmol/L Tris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml胰 RNA酶,0.5%SDS. 2. 消化-TNE （15mmol/
9、L Tris-HClpH8.0,15mmol/LEDTA, 5mmol/L NaCl）4ml，10%SDS0.45 ml，10mg/ml蛋白 酶K（终浓度100g/ml）混匀，503h，45过夜。 3. DNA提取-等体积饱和酚-等体积饱和酚/氯仿/异戊醇（ 25/24/1）-氯仿/异戊醇（24/1）。500r/min,10min. 4. 沉淀DNA-1/10体积3mol/L NaAc，2倍无水乙醇-70% 乙醇。室温挥干。 5. 溶解DNA-适量TE（10mmol/L Tris- HClpH8.0,1mmol/LEDTA,长时间。 五、其他方法 1.Chelex-100提取DNA 基本成分：
10、含有亚氨基二乙酸盐离子的苯乙烯-二乙基 苯共聚物。 基本方法：沉淀细胞；5%试剂200l；560.5h以 上；1008min；剧烈震荡；离心上清。 注意： 离心彻底。 2.硅珠法提取DNA 基本成分：GuSCN（硫氰酸胍，蛋白变性剂）与二氧化 硅（硅珠，核酸吸附剂）。 基本方法：血液（1-4l）TES（100l）SDS （20l）煮沸5min；300lGuSCN溶液 与20l硅珠液保温15 min；离心；离心 加GuSCN溶液；离心加乙醇漂洗； TES5610 min离心取上清。 3.直接煮沸法，10010min 六.注意事项 1. 如消化不完全，可用TNE溶解后再重提。 2. 消化时间宜长不
11、宜短。 3. 操作轻柔。 4. 混匀要充分。 5. 挥干不宜过度。 七.不同生物性检材的DNA制备 1.混合斑二步提取法（精液与阴道液） 原理： 精子细胞膜富含硫醇蛋白，包裹DNA 的鱼精蛋白富含半光氨酸，二硫键丰富，可 抵抗蛋白酶作用。二硫苏糖醇（DTT）可还 原二硫键，使蛋白酶发生作用。 方法: (1)分离细胞成分。 (2)常规消化。 (3)加10%SDS40l，1mol/L DTT16l ， 10g/l蛋白酶K4l，37过夜。 (4)常规处理。 八.DNA定量 1.凝胶电泳半定量分析法 标准参照分析。 2.分光光度计分析 原理：核酸于260nm波长为吸收峰，1OD值 为50g/l双链核酸
12、（40g/l单链核 酸），根据OD值可计算DNA含量。蛋白 于280nm波长为吸收峰，260/280比检测 核酸纯度。1.6-1.8 九.DNA纯化 第三部分 聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction， PCR）在模板DNA和4种脱氧核苷酸 存在的条件下，由一对特异性引物限 定的靶DNA片段，经DNA聚合酶催 化的体外合成过程。 一、 PCR的基本过程 1.变性（denaturation）:在加热的条件下（ 94左右），模板DNA配对碱基间氢键断裂， DNA双链变成单链。 2.退火（annealing）：在降温的条件下（ 55-62），引物与其互补的模板DNA结合形 成杂交双链。 3.延伸（extension）：在合适的温度下（ 68-72），经DNA聚合酶催化4种脱氧核苷 酸，由引物的3端为起始点，从5向3端延伸 ，合成新的与模板DNA 互补的DNA链。 每反应一个循环，靶DNA片段数量增加一倍 ，并以指数的量堆积，经30余次循环，产物量 可达到2105-7个拷贝。几个循环后扩增产物作 为模板。 二、PCR反应的体系 标准体系为50-100l，常用20l。 DNA模板/DNA聚合酶/一对引物/4种脱 氧核苷酸/缓冲液。 反应条件：954-5min,9
