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1、实验三 离心技术一概念生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离的一种技术。沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。主要应用于各种生物样品的分离和制备。二基本原理1离心力（F）F=ma m2r2a：粒子旋转的加速度 m：粒子的有效质量 克为单位：粒子旋转的角速度 弧度/秒 为单位 r：粒子的旋转半径 cm为单位 2相对离心力（RCF）relative centrifuge force通常离心力常用地球的引力的倍数来表示，因而称为相对离心力（RCF）。或者用数字g来表示，例如：13，000g，则表示相对离心力为
2、13，000。相对离心力指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度g（980cm/s2）。RCF=ma/ mg= m2r2/mg=2r2/g=2rpm/60RCF=1.119105（rpm）2rrpm：revolutions per minute为每分钟转数由上式可知，只要给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。由于转头的形状及结构的差异，每台离心机的离心管从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样的，所以在计算时规定旋转半径均用平均半径rav代替：rav（rminrmax）/2低速离心时常以转速rpm来表示，高速离心时则以g表示。报告离心条件时使用RC
3、F比rpm要科学，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。三离心机的主要构造和类型1离心机的分类工业用离心机制备性离心机：分离各种生物材料、分离的样品量比较大实验用离心机分析性离心机：研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，一般有光学系统，可监测粒子在离心场中的行为，能推断物质的纯度、形状和分子量等，都是超速离心机制备性离心机分为：（1）普通离心机最大转速6000rpm左右，最大RCF接近6000g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，室温操作，用于收集易沉淀的大颗粒物质，如：细胞等（2）高速冷冻离心机转速为200025000
4、rpm，最大RCF为8900g，最大容量可达3L，一般都有制冷系统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心室的温度可以调节和维持在04，可以严格准确的控制转速温度和时间，并有指针或数字显示。通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫酸铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器、或单个分子。（3）超速离心机转速可达5000080000rpm，RCF最高可达510000g，离心容量由几十毫升至2升，分离形式为差速沉降分离和密度梯度区带分离，需严格配平（误差0.1g）。可分离亚细胞器、病毒、核酸、蛋白质和多糖等。2转头（1）角式转头角式转头是指离心管腔与转轴成一定
5、倾角的转头。一般有412个装离心管的离心管腔，离心管腔的中心轴与旋转轴之间的角度在2040之间，角度越大沉降越结实，分离效果越好。壁效应：颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧就会出现颗粒沉积，此现象称为“壁效应”。（2）荡平式转头吊篮式（3）区带转头（4）垂直转头（5）连续流动转头3离心管（1）制作材料塑料：聚乙稀（PE）,聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP），PP性能较好优点：透明或半透明，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点：易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短不锈钢：优点：强度大，不变形，能抗热、抗冻、抗化学腐蚀。避免接触腐蚀性的化学药品，如：强酸，强碱等。
6、（2）离心管盖离心前必须盖严，配平时需带管盖重量管盖作用： 防止样品外泄 防止样品挥发 支持离心管，防止离心管变形四制备性超速离心的分离方法1差速沉降离心法最普通的离心法，采用逐渐增加离心速度或低速、高速交替进行离心，使不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法，此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法
7、所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它成分，需经过23次的再悬浮和再离心，才能得到较纯的颗粒。此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒，其优点是：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：须多次离心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒，沉淀于管底的颗粒受挤压，容易变性失活。2. 密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点是：分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，
8、又能分离有一定浮力密度差的颗粒； 颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。此法的缺点是：离心时间较长； 需要制备惰性梯度介质溶液； 操作严格，不易掌握。密度梯度区带离心法又可分为两种：（1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20%的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。
9、离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1.28kg/cm3和60。此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间（2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度
10、的等密度区带离心产生梯度的二种方式。离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CSCl，其密度可达1.
11、7g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。收集区带的方法有许多种，例如：（1）用注射器和滴管由离心管上部吸出。（2）有针刺穿离心管底部滴出。（3）用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。（4）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。五离心操作的注意事项1配平2装载溶液的量：不得装过多液体，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀制备性超速离心机的离心管，要求必须将液体装满，以免塑料离心管的上部凹陷变形。3低温离心：预冷4离心过程不得随意离开，应随时观察5严格按照转头的最高允许转速和
12、使用累计期限要求操作6若转头有盖子，一定盖上 第十一章 核酸实验1核糖核酸及脱氧核糖核酸提取原理核酸是重要的生物大分子，在体内通常与蛋白结合，以核糖核酸蛋白（RNP）和脱氧核糖核酸蛋白（DNP）的形式存在，并分别主要存在于细胞质和细胞核中。分离RNP与DNP是根据二者在不同浓度的盐溶液中的溶解度不同进行的。RNP在低浓度（0.14M）溶液中溶解度较大，而DNP则在高盐溶液（11.7M）中溶解度较大，因此在提取分离核酸时可采用增加和降低盐的浓度来达到分离目的。本实验用氯仿异戊醇使蛋白质变性沉淀，经离心溶液分为三层，下层为氯仿，中层为变性蛋白质，上层为含有核酸的水溶液。再利用无水乙醇将RNA沉淀出
13、来。2RNA与DNA的测定RNA分子中的核糖在浓酸中加热，脱水转变成糖醛，糖醛在氯化铁存在下与地衣酚试剂反应，缩合成绿色化合物，在670nm处有最大吸收峰，从而可进行定量测定。20200ug/ml之间时，ACDNA分子在酸性溶液中加热水解后，其脱氧核糖部分可被浓酸缩水成羟基酮基戊醛等化合物，再进一步与二苯胺作用，可产生蓝色化合物，在595nm处有最大吸收峰，从而定量，20200ug/ml之间时，AC3. 操作步骤RNA的提取与鉴定（1）制备匀浆取新鲜动物肝脏剪成碎块，放入高速组织捣碎机中，并用冰冷的0.14mol/L的NaCl溶液制成15的匀浆。（2）RNP与DNP的分离取匀浆4mL，加入小试
14、管中， 3000rpm离心10min，将上层RNP提取液转移至另一小试管中（下层沉淀中含有DNP，留待作DNA的提取实验）。（3）去除蛋白质于RNP提取液中加入等体积氯仿溶液，用玻璃纸堵住管口振摇2min，3000rpm离心10min，此时管中液体分为三层，下层为氯仿，中间为变性的蛋白质，上层为含有核酸的水溶液，将上层转移至另一小试管中，加入二倍体积冰冷的95乙醇，用玻璃棒轻轻交办见有RNA沉淀出来，3000rpm离心5min，弃去上层乙醇溶液，沉淀即为RNA粗制品。（4）鉴定取中试管3支，按下表操作RNA的测定方法表试剂（mL）标准管标本管空白管RNA标准液1.0RNA提取液1.0蒸馏水1.
15、0地衣酚试剂3.03.03.0混匀各管，置于沸水浴中加热10min，取出冷却，以空白管调零点，在670nm波长处比色，读取各管的吸光度。计算：（OD标本/OD标准）100（4/0.6）RNAg/g肝组织DNA的提取与鉴定（1）肝匀浆制备与RNA分离，见RNA的提取（2）于含有DNP的沉淀中加入二倍体积的1mol/L的NaCl溶液搅拌均匀，室温放置56h，以充分提取DNP。（3）去除蛋白质将放置完毕的DNP悬混液 3000rpm离心10min，将上层DNP提取液转移至另一小试管中于，加入等体积氯仿溶液，用玻璃纸堵住管口振摇2min，3000rpm离心10min，此时管中液体分为三层，下层为氯仿，中间为变性的蛋白质，上层为含有核酸的水溶液，将上层转移至另一小试管中，加入二倍体积冰冷的95乙醇，边加边摇匀，此时可见有白色纤维状DNA，300
