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1、中南大学 硕士学位论文 KCNJ11、TCF7L2基因多态性与2型糖尿病中瑞格列奈疗效的相关 性研究 姓名：余敏 申请学位级别：硕士 专业：临床药理学 指导教师：刘昭前 20090501 硕士学位论文中文摘要 摘要 目的：基因编码的参与胰岛素分泌和葡萄糖代谢的重要蛋白质发生 缺陷常常会导致2 型糖尿病的发生。K C N J ll 基因编码的K i r 6 2 蛋白及 T C F 7 L 2 因子均在胰岛素分泌和葡萄糖代谢过程中的发挥着重要作用，并 参与胰岛1 3 细胞功能调节。本研究旨在分析K C N J l l 基因r s 5 2 1 9G A 突 变和T C F 7 L 2 基因r s 2
2、 9 0 4 8 7C T 突变在中国2 型糖尿病病人和健康人群 中的分布特征，同时探讨中国汉族2 型糖尿病病人这些遗传多态性对瑞 格列奈疗效的影响。 方法：采用聚合酶链式反应限制性片断长度多态性( P C R R F L P ) 对 2 9 5 名2 型糖尿病患者和1 8 8 名健康对照者进行K C N J l l ，T C F 7 L 2 基因 型分析，随机选择部分样品应用直接测序法验证P C R R F L P 结果；4 0 名 糖尿病患者每天口服3 m g 瑞格列奈，持续8 周，服药前和服药第8 周末 收集血标本5 m l ；应用酶氧化法测定血糖、放射免疫法测定胰岛素、高效 液相色谱法
3、测定H b A I c 等反映糖效应的指标。应用单因素方差分析、非 参数检验、两样本T 检验、配对T 检验和卡方检验进行统计学分析。 结果：K C N J l1 ，T C F 7 L 2 等位基因的发生频率均符合H a r d y W e i n b e r g 平衡。K C N J l l 基因r s 5 2 1 9 位点A 等位基因频率在糖尿病患者和健康对 照人群分别为3 4 6 和3 2 7 ，不存在显著性差异( P O 0 5 ) ：该突变与2 型糖尿病患者的F P G ，P P G 浓度有一定相关性，表现为G G 、G A 型患者 F P G 均明显高于A A 型( P O 0 5
4、) ，而G G 与G A 型患者之间F P G 无显著 差异，G G 型患者P P G 明显高于G A + A A 型( P O 0 1 ) ，且G A 与A A 型患 者之间P P G 无明显差异；瑞格列奈使用8 周后，G A + A A 型患者F P G 、 P P G 及H b A I c 的下降值均明显高于G G 型( P O 0 5 ) ；该突变与2 型糖尿病 患者B M I ，C H O 浓度有一定相关性，表现为C C 型患者B M I 明显低于 C T 、T T 型( P O 0 5 ) ，C H O 却明显高于C T 、T T 型( P O 0 5 ) ，但上述两 指标在C T
5、 、T T 型之间却不存在显著性差异；瑞格列奈使用8 周后，C C + C T 型患者F I N S 的增加值明显低于T T 型C o O 0 5 ) ，而T G 及L D L c 的下降 值均明显低于T T 型( p O 0 5 ) F u r t h e r s t u d ys h o w e dt h a tt h ev a r i a t i o no fK C N J 1 lr s 5 219w a sa s s o c i a t e dw i t ht h e l e v e l so fF P Ga n dP P G ，t h ec a r r i e r sw i t hG
6、a l l e l ei nT 2 D Mp a t i e n t sh a d s i g n i f i c a n t l yh i g h e rF P Ga n dP P Gl e v e l ( P O 0 5 ) M o r e o v e r ，w ef o u n dt h a t t h er s 2 9 0 4 8 7m u t a t i o ni nT C F 7 L 2g e n ew a sm a r k e d l ya s s o c i a t e dw i t ht h e l e v e l so fB Ma n dC H Oi nT 2 D Mp a
7、 t i e n t s ，s u b j e c t sw i t hCa l l e l eh a dl o w e r B M Ia n dh i g h e rC H Ov a l u e sc o m p a r e dw i t hT Tg e n o t y p e s ( P O 0 5 ) F i n a l l y , w ef o u n dt h a tp a t i e n t sw i t hG A + A Ag e n o t y p e si nK C N J 1 lg e n eh a dm o r e d e c r e a s ei nF P GP P G
8、 , a n dH b A l ct h a nt h a ti nG Gg e n o t y p e s ( P _ 1 1 1 m m o l L 。收集T 2 D M 患者2 9 5 例，平均年龄为4 9 7 4 - 9 7 岁。根据病史和家 族史排除l 型糖尿病、妊娠糖尿病、高血压和严重肝肾疾病。 2 2 2 健康对照组 3 硕士学位论文第一章材料和方法 健康对照组1 8 8 例，平均年龄4 8 3 4 - 1 0 0 岁。健康对照组选自与T 2 D M 患者同一地 区的无血缘关系的群体，且排除肝、肾及内分泌代谢性疾病，无高血压、糖尿病病 史及家族史。 2 3 实验方法 2 3 1
9、血糖和其它临床指标的测定方法 血清( 浆) 样本送中南大学湘雅医院检验科，以B e c k m a n 公司( 美国，加利福尼亚 州，帕萨迪纳) 自动生化仪酶氧化法测定血糖、美国D S L 公司( 美国，德克萨斯州，韦 伯斯特) 放射免疫试剂盒测定胰岛素。H b A l c 用高效液相色谱法测定。全自动生化分 析仪( H i t a c h i7 4 7 ，B o e h r i n g e rM a n n h e i m ，M a n n h e i m ，G e r m a n y ) 钡U 定C H O 、T G 、H D L c 及L D L - c 等指标。H O M A - I
10、R = F P G ( m m o l L ) XF I N S ( m U I ) 2 2 5 ，B M I = 体重( k g ) ( 身高 ( m ) ) 。】。 2 3 2D N A 抽提方法 抽取每位受试者的肘静脉血5 m L ，用标准的苯酚一氯仿萃取法手工提取其D N A ， 具体步骤如下。 2 3 2 1 试剂的配制 1 1 0 S D S 称取1 0 9 S D S ，溶于8 0 m L 双蒸水中，用I m o l L 盐酸校正p H 至7 2 ， 定量到1 0 0 m L ，室温下保存。 2 1 MT r i s H C I 广_ 一1 8 1 7 9 的T r i s 用双
11、蒸水溶解，用浓盐酸调p H 至7 6 ，定容至 1 5 0 m L 。 3 0 5 ME D T A - 1 8 6 1 9N a 2 E D T A 2 I - 1 2 0 ，加入约8 0 0 m L 双蒸水溶解，用N a O H 调节p H 值至8 O ( 约2 0 9 N a O H ) 后定容至1 0 0 0 m L 。 4 5 MN a C l 称取2 9 2 2 9N a C I 加双蒸水8 0 0 m L 溶解后定容至1 0 0 0 m L 。 5 0 5 MM g C l 2 称取1 0 1 7 9 M g C l 2 6 H 2 0 加双蒸水8 0 0 m L 溶解后定容至1
12、 0 0 0 m L 。 6 T E 溶液l M 的T r i s H C L5 m L 与0 5 M 的E D T Al m L 加双蒸水溶解至5 0 0 m L 。 7 1 0X 红细胞裂解液( R C L B 卜1 M 的T r i s H e l5 0 m L 、0 5 M 的M g C l 25 0 m L 以及5 M 的N a C I1 0 m L ，加双蒸水溶解至5 0 0 m L 作为贮存液保存。使用时将之稀释1 0 倍。 8 白细胞裂解液( W C L B 卜1 M 的T r i s H C Ll m L 与0 5 M 的E D T A2 m L 以及5 M 的 N a C
13、Il m L ，加双蒸水定容至1 0 0 m L 。 9 蛋白酶K 称取蛋白酶K 粉末用双蒸水配成2 0 m g m L 的溶液，- - 2 0 。C 保存， 临用前解冻。 2 3 2 2D N A 提取步骤 1 血样于2 5 0 0 r p m 离心5 分钟，留取沉淀细胞层。 4 硕士学位论文第一章材料和方法 2 将沉淀细胞层置于5 0 r a L 灭菌离心管中，加R C L B2 0 - - 2 5 m L ，冰浴3 0 分钟。4 0 C 下2 5 0 0 r p m 离心l O 分钟，弃上清。再加R C L B2 0 - - - 2 5 m L ，冰浴1 0 分钟。 3 重复4 0C 下
14、2 5 0 0 r p m 离心l O 分钟，弃上清后加入W C L B2 7 m L 、1 0 S D S2 0 0 9 L 和蛋白酶K1 5 止( 使其终浓度为l O O g g m L ) 。 4 在3 7 0C 下水浴过夜。 5 水浴过夜后的混合液中，加入平衡酚与氯仿各2 m L ，振荡混匀l O 分钟。 6 4 0 C 下新混合物3 0 0 0 r p m 离心l O 分钟，将上层液转移至另一试管中。 7 加入预冷的无水乙醇3 0 m L ( 2 5 倍体积) 来回颠倒数次，即可见絮状沉淀物( D N A ) 。 8 用玻璃勾针勾出D N A ，7 0 乙醇冲洗后室温下干燥2 0 分
15、钟。 9 即可将D N A 溶于5 0 0 恤L 的T E 溶液中，4 0C 下储存。 2 3 2 30 8 9 6 琼脂糖凝胶的制备 1 称取o 4 9 琼脂糖粉置于含有5 0 m L 电泳缓冲液( 1XT A E ) 的锥形瓶中。 2 在微波炉中将悬浮液加热至琼脂糖溶解，约需2 - 3 分钟。 3 使溶液冷却至6 0 0C ，加入溴化乙锭( 用水配成l O m g m L 的储存液) 2 0 止，充分混 匀。 4 用吸管取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，任其凝固。 5 将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，凝胶的厚度在3 - 5 r a m 之间。插入梳齿，距 离底板0 5 - 1 r a m ，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。 6 在凝胶完全凝固后( 于室温放置3 0 - 4 5 分钟) ，小心移去梳齿，将凝胶放入电泳槽 中。加入恰好没过胶面约l m m 深的足量电泳缓冲液。 7 1 0 止D N A 样品与上样缓冲液混合后，用一次性微量移液器将混合物加至样品槽中。 盖
