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1、发酵工程学科的进展 第四次全国发酵工程学术讨话套论文枭 真菌a 一淀粉酶产生菌的筛选及其固态发酵 条件的初步研究* 李江华h 2 ，房峻2 ( 1 江南大学教育部工业生物技术重点实验室，无锦，江苏Z 1 4 0 3 6 2 江南大学生物工程学院，无锝江苏Z 1 4 0 3 6 ) 摘要：从滔曲和酒药中分离筛选出一株产r 淀粉酶的菌株A 0 1 9 经形态学初步鉴定为米 曲霉。研究了碳豫、氟谭、培养温度与时问等目素对A 0 1 9 产酶的影响较适的培养基组成 和培养条件为t 麸皮8 9 ，豆饼粉2 2 8 9 ，酵母膏0 1 9 。K ：H P o 3 H 2 01 ，M g S 0 4 7 H
2、 2 0 0 0 9 4 ，加水量1 2 9 m L ，培养基的起始p H 5 0 左右，2 8 培养4 8 h ，在此条件下r 淀粉酶的 酶 舌达到4 1 0 U g 干曲左右 前言 中国是世界上最大的小麦生产和消费国。随着人民生活水平的日益提高和食品工 业的不断发展，人们对面粉的品种和品质提出了愈来愈高的要求。面粉生产企业为适应 市场新的需求，近年来陆续开发生产了各类专用面粉。在生产面包、馒头等制作发酵食 品的专用面粉时，除面粉的面筋、灰分、粗细度、粉质曲线稳定时间等常规质量指标外面 粉工作者越来越关注面粉的口一淀粉酶活性。一般情况下，正常季节收获的小麦加工的面 粉中a 一淀粉酶的含量普遍
3、不足，为改善和提高面粉类食品的质量可在面粉加工的过程中 添加r 淀粉酶。口- 淀粉酶是非常重要的工业酶种之一，在食品和酿造工业中有非常广泛 的用途。a 一淀粉酶主要由以下三种形式存在：细菌C t - 淀粉酶、真菌a 一淀粉酶、麦芽a 一淀粉 酶。细菌a - 淀粉酶热稳定性较强其钝化温度高达9 5 以上，在面食品的高温加工过程仍 对淀粉具有水解作用，易使面团心发粘。麦芽a - 淀粉酶酶活性较低，添加量为面粉的0 2 O 4 ，因粘性较大，在实际应用中混合均匀较为困难。真菌a 一淀粉酶热稳定性较差， 6 5 以下就已失活，即使添加量过多，也不会造成面团心发粘的质量问题。因此近年来， 在我国面粉生产
4、企业中，真菌n - 淀粉酶已逐步得到推广与应用，并取得了良好的经济与 社会效益“。而且除了在面粉工业中的应用外，真菌a - 淀粉酶在淀粉糖工业和酿造工 业中也有非常广泛的用途”。真菌a 一淀粉酶也成为一个引人关注的高效新型工业酶 种，引起了许多研究者的关注 1 “】。本研究从实验室收集的酒曲和酒药中分离得到一株 能产生的真菌口一淀粉酶菌株，编号为A 0 1 9 ，初步鉴定为米曲霉，对该菌株的固态发酵产 酶条件进行了初步的研究，现将结果报道如下。 - 作者简介：李江华( 1 9 6 6 一) ，用，副教授。硕士主要从事发酵工程和酶技术的研究 李江华等：真菌口- 淀耪酶产生苗的筛选及其固态发酵条件
5、的初步研究- 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 菌种 分离自酒曲和酒药中。 1 1 2 培养基 1 ) 斜面培养基( g L ) 蔗糖3 0 ，N a N a3 ，M g S o 7 巩O0 5 ，F e S o 7H 2 00 0 1 ，K 2 H P q 3 H 2 01 ， K C l0 5 ，琼脂2 0 ，p H 自然。 2 ) 平板分离培养基( g L ) 蔗糖3 0 ，N a N 0 33 ，M g S 0 4 7 H 2 00 5 ，F e S O 7 H 2 00 0 1 ，K 2 H P q 3 H 2 01 ， K C l0 5 ，玉米淀粉2 0 琼脂2 0 p H
6、 自然。 3 ) 筛选培养基 2 5 0 m L 三角瓶中，麸皮7 9 ，豆饼粉3 9 ，K 2 ：- I V 0 4 3 H 2 00 3 ，M g S 0 4 7 H 2 00 10 A ，( N H ) 2 s o 1 ，水1 3 m L 。p H 自然。 4 ) 固态发酵培养基 2 5 0 m L 三角瓶中，麸皮8 9 ，豆饼粉2 2 8 9 ，酵母膏0 1 9 ，K 2 H P n 3 H 2 01 ，M g S O 7 H z O0 0 9 4 ，水1 2 9 m L 。p H 5 0 。 1 2 方法 1 2 1 平板筛选方法 将将酒曲和酒药用无菌水适当稀释，取一定量涂布于平板分
7、离培养基3 0 C 培养，产 a 一淀粉酶的菌株会分解底物玉米淀粉产生透明圈，依据产生透明圈的早晚和透明圈直径 与茵落直径比值的大小分离出a 一淀粉酶活性相对较高且产酶周期短的菌株，挑至斜面上 保存。 1 2 2 复筛及发酵方法 将初筛菌种接人固体培养基中，3 0 C 恒温恒湿培养4 8 h 后，测定a 一淀粉酶活力。 1 2 3 酶活力的测定方法 1 ) 酶液制备 发酵结束后，称取1 9 固体曲，加1 0 m l 蒸馏水，2 5 浸提3 0 r a i n ，然后过滤，取滤液适 当稀释测定酶活力。 2 ) 酶活力测定“ 取2 0 m l2 的可溶性淀粉溶液和5 m lp H4 8 磷酸氢二钠
8、一柠檬酸缓冲溶液于比色 管中，5 0 恒温水浴中预热1 0 m i n ，然后加入适当稀释的酶液0 5 m l ，充分摇匀定时取出 反应液0 5 m l 滴在预先装满稀碘液的白磁板空穴内，当颜色反应由紫色变成红棕色，最 终与标准终点色相同时，为反应终点，记录反应时同。由反应时闾计算酶活力。在上述 条件下，每小时液化1 克可溶性淀粉所需的酶量定义为一个a - 淀粉酶单位。 1 2 4 水分的测定 第四次全国发酵工程学术讨论会 湿曲在1 0 5 干燥至恒重测定 2 结果与讨论 2 1 菌种筛选 将实验室收集的酒药和酒曲稀释涂布于 平板分离培养基形成单菌落，培养9 6 h ，挑取 透明圈直径与菌落直
9、径比值相对较大的菌落 姜墓蒹薯；共5 羹；嚣籀怠嚣蔫围- 一态酵复筛得到株产酶较稳定的菌株其中发现 1 9 号号菌株产酶最高且稳定。1 9 号菌株发酵4 8 h 酶活达到1 9 5 U g 干曲。该菌株在平 板分离培养基上培养4 8 h 时所形成的水解圈见图1 。我们选取1 9 号作为下一步研究的 菌株，并将该菌株编号为A 0 1 9 。 2 2 菌株形态 A 0 1 9 于固体平板培养基上培养较长时间后菌落呈白色，产少量淡绿色孢子。镜检 发现，菌丝体有横隔，具有分生孢子梗并且在顶部膨大成椭圆形，顶囊上有小梗，小梗自 顶囊表面呈放射状生出，小梗双层。每个梗基上着生两个或多个小梗。每个梗上有一至
10、 多个分生孢子。根据A 0 1 9 的菌落特征和菌丝与分生孢子的形态特点等，A 0 1 9 初步鉴定 为米曲霉 1 目。 2 3 固态发酵产酶条件的研究 2 3 1 碳源对产酶的影响 以筛选培养基为基础培养基，分别添加1 的各种碳源，静置培养4 8 h ，测定其酶活。 结果表明( 表1 ) ，外加的碳源中，除蔗糖外，其它的碳源对酶的合成有不同程度的抑制作 用。乳糖和葡萄糖对酶合成的抑制可能是易利用碳源对水解酶合成具有阻遏作用的缘 故。淀粉作为淀粉酶的底物应该对产酶具有促进作用，但在本实验中结果却相反，其可 能的原因是筛选培养基中所用的固体基质麸皮还残余一定量的淀粉，外加淀粉后导致其 过量，反而
11、对酶的合成产生抑制作用。因此在后续的实验中不添加任何碳源。 裹1 碳源对产酶的影响 2 3 2 氮源对产酶的影响 以不含豆饼粉和硫酸铵的筛选培养基为基础培养基，在其中分别加人4 种无机氮源 李江华等。真菌r 淀粉酶产生菌的筛选及其同态发酵条件的初步研究 和4 种有机氮源，培养4 8 h 后分别测定其酶活。结果表明( 表2 ) ，豆饼粉、酵母膏和牛肉 膏效果较佳，其次为蛋白胨。无机氮源中硝酸钠和硫酸铵对产酶有一定的促进作用，但 效果一般。而硝酸铵和磷酸氢二铵则对酶的合成有抑制作用。 裹2 氯谭对产酶的影响 基础培养基的组成：2 5 0 m L 三角瓶中，麸皮9 9 。无机盐溶液1 3 m L 无
12、机盐溶液的组 成：K 2 H P 0 4 3 H 2 00 3 ，M g S O 7 H 2 00 1 ，外加氮源。对照不外加氮源。 2 3 3 豆饼粉浓度对产酶的影响 从氮源试验中可知，以豆饼粉作为氮源产酶效果最佳。因此改变豆饼粉和麸皮的比 例考察不同豆饼粉浓度对产酶的影响( 表3 ) 。结果表明，豆饼粉和麸皮的比例为2 ：8 时 产酶水平最高，进一步加大豆饼粉的浓度反而使发酵酶活降低了，这可能是由于豆饼粉 浓度过高导致培养基粘结，影响氧的传递，阻碍了菌体的呼吸和代谢，导致产酶能力 下降。 衰3 豆饼粉禳度对产酶的影响 2 3 4 复配氮源对产酶的影响 从表2 的结果可知，豆饼粉、酵母膏和牛
13、肉膏均为产酶的较佳氮源。因此将这三种 氨源进行复配，考察其对产酶的影响。结果表明( 表4 ) ，在以豆饼粉为氮源的基础上再添 加酵母膏或牛肉膏除了豆饼粉和酵母膏的组合对产酶有一定促进，其余组合对产酶的 促进不明显。 第四次垒国发酵工程学术讨论会 衰5 复配氟源对产酶影响 2 3 5 培养基中加水量对产酶的影响 试验不同加水量对产酶的影响。从图2 的结果可以看出，水分含量对产酶有较大的影 响。在培养基中加入1 3 m l 左右的水( 即加水 比为l ：1 3 左右) 时，产酶水平最高。 2 3 6 无机盐对产酶的影响 试验了不同浓度K H z P O , ，M g S O 。对产 酶的影响。从表
14、6 的结果可以看出，在实验选 用的浓度范围内K H z P n 对产酶的影响不明 显，而M g S O 。对产酶则有较显著的影响。 K H 。P O 和M g S O 。的较适浓度分别为1 和 0 1 圈2 培养基中水含量对产酶的影响 衰6 无机盐对产酶影响 2 3 7 培养基组成的优化 响应面分析方法已被广泛应用于发酵过程实验的设计，根据B O X B e I l l l n k e n 的中心 组合设计原理“。本实验设计了三因素三水平的响应面分析实验。 从前面的实验可以看出培养基中豆饼粉含量、M g S o 含量和加水量对酶活影响较 大，所以实验选定豆饼粉( z 1 ) ，M g S 0
15、( z 2 ) ，加水量( ) 三个因素为自变量，以酶活( y ) 为 响应值。实验因素与水平的选取如下：z 1 1g ，2 9 ，3 9 ；z _ 20 0 5 ，0 1 0O A ，0 1 5 “ 1 2 m L 1 3 m L ，1 4 m L 。其它培养基成分如实验与方法所述的发酵培养基，实验结果如表7 。 李江华等：真菌旷淀粉酶产生菌的筛选及其固态发酵条件的初步研究* 3 4 7 注：x 1 = z I 一2 ，x 2 = ( - - 0 1 ) * 2 0 ，均= 函一1 3 。 由表7 中数据用S A S 程序计算出回归方程中各系数，得方程如下： Y I = 3 7 6 + 6
16、3 7 5 * x l 一8 6 2 5 * x 2 5 * x 3 1 5 7 5 * x l * x l 一1 4 x l * x 2 5 4 2 5 。x 2 * x 2 1 1 2 5 * x 1ox 3 1 2 5 * x 2 * x 3 5 5 * x 3 * x 3 裹8 回归方程的方差分析 F o o l ( 9 ，5 ) ；1 0 1 6 经F 检验，F = 1 9 2 7 F o 。( 9 ，5 ) = 1 0 1 6 ，说明回归方程在a = 0 0 1 水平上是显著 的，亦即，响应面( y ) 与各实验因子存在显著的线形相关。 进一步对回归方程各项( 回归系数) 作显著性检验，结果见表9 。方
