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1、华中科技大学 博士学位论文 牛蒡子苷元抗炎机理及双氢杨梅素对神经细胞保护机制的实验 研究 姓名：寇现娟 申请学位级别：博士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：戴五星 2011-05 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 3 牛蒡子苷元的抗炎机理研究牛蒡子苷元的抗炎机理研究 中文摘要中文摘要 牛蒡子苷元（Arctigenin）是从菊科两年生草本植物牛蒡属牛蒡 Arctium lappaL 的 干燥成熟果实牛蒡子中分离而来的木脂素类化合物。牛蒡子为我国传统中药，有广泛 的生物学效应：抗炎，抗氧化，抗肿瘤，神经细胞保护作用。另外，Arcti
2、genin 能够 抑制 HIV 病毒的复制。在我国，Arctigenin 用于治疗炎症有悠久的历史。以前的研究 发现，Arctigenin 能够抑制 LPS 诱导的 NF-B 的活性。到目前为止，有关 Arctigenin 的报道大都集中在 NF-B 通路。在本研究中，我们探讨了 Arctigenin 抗炎的其他信号 机制。 JAK-STAT 信号通路能够被包括细胞因子和生长因子在内的许多配体激活，从而 介导免疫和炎症反应。JAK 家族包括四个成员：JAK1，JAK2，JAK3 和 TYK2，然而 在巨噬细胞中主要以 JAK2 表达为主。细胞被适当的配体刺激后可以诱导受体的寡聚 化并且导致局部
3、的 JAKs 聚集增加，继而引起他们的磷酸化。JAKs 的磷酸化可以引起 下游的 STATs 磷酸化。 当 JAKs 被磷酸化后，STATs 就转录到核内从而调控相关靶基 因如 iNOS 和 COX-2 等的表达。 细胞因子源的免疫信号在强度和时间上通常受到严密的调控。JAK-STAT信号的 抑制性分子（SOCSs）家族是JAK-STAT信号的负调控因子。SOCS家族由SOCS1-7， 和CIS（细胞因子诱导的Src同源结构域蛋白）组成。SOCS蛋白通过直接和JAK家族蛋 白或者磷酸化的酪氨酸残基相互作用抑制JAK-STAT信号。 以前的研究证实 Arctigenin 具有抗炎作用，但是其抗炎
4、的分子机制仍然不清楚。 在本研究中，我们发现 Arctigenin 有效地抑制了 LPS 诱导的 iNOS（ mRNA，蛋白） 基因表达及酶活性。 抗炎效应部分上归功于 Arctigenin 对 ROS 依赖的 JAK-STAT 信号 通路的抑制。 与抗氧化剂 NAC 相似， Arctigenin 明显的抑制了 STAT1 和 STAT3 的磷 酸化，从而阻断了 STAT1 和 STAT3 的入核。利用 iNOS 的荧光素酶基因实验，我们 发现 LPS 刺激后，iNOS 的转录活性明显升高。 然而 Arctigenin 预处理剂量依赖地降 低 iNOS 的转录活性。同时，转染 STAT1(Y7
5、F)和 STAT3(Y7F)组的 iNOS 的转录活性 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 4 也被抑制。这些结果说明 STAT 通路是 iNOS 转录的重要调控子，从而抑制 STAT 介 导的反应基因 iNOS 的产生。 为了进一步证实 Arctigenin 的抗炎效应是否由抑制 STAT 信号所致，我们检测了 STAT 介导的反应基因 IL-1，IL-6 和 MCP-1 的产生。研究显 示，Arctigenin 预处理剂量依赖地降低 LPS 诱导的炎症因子的产生。接下来，我们的 研究进一步证实， Arctigenin能够抑制JAK2
6、的磷酸化， 而不能抑制JAK1。 另外， SOCSs 的诱导表达也是 Arctigenin 抑制 JAK-STAT 信号的机制之一。 Arctigenin 预处理能够诱 导 SOCS3 的表达， 而 SOCS1 则不受其影响， 这意味着 SOCS3 有助于 Arctigenin 抑制 JAK-STAT 信号通路。这些结果说明 Arctigenin 能够抑制 IL-1，IL-6 和 MCP-1 的产 生，而这些过程则需要 JAK2-STAT1/3 信号的抑制。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 5 Study on Anti-infla
7、mmatory mechanism of Arctigenin Abstract Arctigenin, a bioactive constituent from dried seeds of Arctium lappa L. Arctigenin is a common herbal medicinal preparation in China,which has been reported to exhibit anti-inflammatory ,antioxidant, antitumor，neuroprotective effectes. Moreover，Arctigenin al
8、so inhibited the replication of human immunodeficiency virus. In China, Arctigenin has been used clinically as a therapeutic agent to treat inflammation several years. Previous studies demonstrated that Arctigenin suppressed the activation of NF-B stimulated by LPS. Up to date, resports on the mecha
9、nism underlying the anti-inflammatory effect of Arctigenin are limited to study on the inhibition the activation of NF-B. Thus, in the present study, we study another potent mechanism underlying the anti-inflammatory effect of Arctigenin. The JAK-STAT signaling pathway may be activated by diverse li
10、gands, including cytokines and growth factors, mediates the immune and inflammatory response. The JAK family consists of four members, namely, JAK1, JAK2, JAK3, and TYK2, whereas in macrophages JAK2 is dominantly expressed. The stimulation of cells with suitable ligands, induces receptor oligomeriza
11、tion and causes the local aggregation of associated JAKs, which results in their activation by phosphorylation. JAKs are activated by tyrosine transphosphorylation, which allows them to phosphorylate their major downstream targets-STATs. When tyrosine is phosphorylated by JAKs, STATs are translocate
12、d to the nucleus to regulate the transcription of target genes,such as iNOS and COX-2. Cytokine-derived immune signaling is strictly regulated with respect to both magnitude and duration. Suppressor of cytokine signaling (SOCS) family proteins are negative feedback regulators of the JAK-STAT signal
13、pathway. The SOCS family consists of eight members, cytokine-induced SH2 protein (CIS) and SOCS1-7, SOCS protein inhibits JAK-STAT signaling by directly interacting with JAK family proteins or with phosphorylated tyrosine residues in the cytokine receptors. Arctigenin has been strongly implicated as
14、 an anti-inflammatory agent, but the precise 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 6 mechanisms of its action are still unknown. In the current study,we foud that Arctigenin effectively inhibited iNOS (mRNA, protein) gene expression and enzyme activtiy. Its anti-inflammatory effects appear
15、in part to be due to the suppression of the ROS-dependent JAK-STAT inflammatory signaling pathway. Like as N-acetyl-L-cysteine, Arctigenin markedly inhibited the phosphorylation of STAT1 and 3, thus blocked their translocation to the nucleus. In the iNOS-luciferase assays, we foud the gene promoter
16、activitie of iNOS was significantly increased by LPS stimulated. However, pretreated Arctigenin suppressed the report gene activity of iNOS by dose-dependent manner. At the same time, cells expressing dominant negative mutant STAT1 (STAT1YF) or dominant negative mutant STAT3 (STAT3YF) also reduced gene promoter activitie, meaning that STAT1 or STAT3 is a major molecule in regulating iNOS gene expr
