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1、第一军医大学 硕士学位论文 晚期氧化蛋白产物对人血管内皮细胞的生物学作用 姓名：袁方 申请学位级别：硕士 专业：内科学（肾脏病） 指导教师：刘尚喜;侯凡凡 20040610 缩略语词汇表 英文缩写英文全称 A O P P A S A A S A G E B S A C R F D C F H D M S O H U E C V L D L L N N A M T T 中文全称 a d v a n c e do x i d a t i o np r o t e i np r o d u c t s晚期氧化蛋白产物 A t h e r o s c l e r o s i s动脉粥样硬化 a c c
2、 e l e r a t e da t h e r o s c l e r o s is加速型动脉粥样硬化 a d v a n c e dg l y c a t i o ne n dp r o d u c t s晚期糖基化终产物 b o v i n es e r u ma l b u m i n C h r o n i cr e n a lf a i l u r e 2 7 - d i c h l o r e f l u o r e s c e i n d i m e t h y ls u l f o x i d e 牛血清白蛋白 慢性肾功能衰竭 2 ，7 - 二氢二氯荧光素 二甲基亚砜 h
3、u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a l 人脐静脉内皮细胞 c e l i s l o wd e n s i t yI i p o p r o t e i n N w N i t r o 。L A r g i n i n e 低密度脂蛋白 左旋硝基精氨酸 3 一( 4 ，5 - d i m e t h y l t h i a z o l y 一2 )四甲基偶氮哗蓝 2 ，5 - d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e N A D P Hn i c o t i n a m
4、 i d e a d e n i n ed i n u c l e o t i d e 还原型烟酰胺腺嘌呤 p h o s p h a t e 2 二核苷酸 N O Sn i t r i co x i d es y n t h a s e 一氧化氮合酶 O x L D Lo x i d i z e dl o wd e n s i t y l i p o p r o t e i n氧化型低密度脂蛋白 R O S S O D V E C s u p e r o x i d ed is m u t a s e 吡咯烷二硫代氨基 甲酸酯 活性氧 超氧化物岐化酶 v a l c u l a re n d
5、 o t h e l i a lc e l l s 血管内皮细胞 晚期氧化蛋白产物对人血管内皮细胞的生物学作用 摘要 背景 动脉粥样硬化( A S ) 是慢性肾衰( C R F ) 病人常见的心血管并发症， C R F 时A S 的发病率较同龄般人群明显增高，且发病年龄提前至3 0 一4 0 岁，故被称为“加速型动脉粥样硬化”( A A S ) ，其发病机制目前还不完全 清楚。已有研究证实，血液透析过程中，血细胞接触生物相容性欠佳的 透析膜或透析液中污染的内毒素可激活循环中性粒细胞和单核细胞，产 生大量的活性氧( R O S ) 。R O S 可氧化修饰低密度脂蛋白( L D L ) 产生氧
6、化型低密度脂蛋白( O x - - L D L ) ，后者是导致A s 的重要因素。近年大量 文献证实，透析前的轻一中度肾功能减退的病人体内R O S 水平已明显升 高。研究表明，体内蓄积的某些尿毒症毒素可能与C R F 病人的氧化应激 有关，晚期氧化蛋白产物( A O P P ) 就是近年引起重视的这类大分子毒素 之。1 9 9 6 年W i t k o S a r s a t 等发现C R F 病人血浆中A O P P 水平明显增高， 主要存在于白蛋白中，特征是酸性条件下在3 4 0 n m 有特异吸收峰。在体 外用次氯酸( H o c l ) 与白蛋白作用可得到与C R F 病人血浆中相
7、似的A O P P 。 已证实，轻一中度肾功能减退的病人循环A O P P 水平己明显增高，且随肾 功能恶化进行性增加，被认为是一种反映C R F 时氧化应激的新的标志物。 中性粒细胞活化时髓过氧化物酶( M P O ) 催化产生的H O C I 可能修饰血浆 蛋白而生成过量A O P P 。体外研究发现，A O P P 可引起中性粒细胞和单核细 胞的呼吸爆发，提示A O P P 可能是种具有促炎症活性的尿毒症毒素。 最近研究发现A O P P 可能与动脉粥样硬化( A S ) 的发生有关。动脉 粥样硬化患者血浆A O P P 水平明显高于正常人；血液透析的C R F 病人颈动 脉内膜厚度与血
8、浆A O P P 水平呈正相关；静脉反复注射A O P P 可加速喂高 胆固醇饲料兔动脉粥样硬化斑块的形成。上述研究提示A O P P 可能参与了 A S 的形成，但其机制目前还不清楚。本文旨在研究A O P P 对血管内皮细 胞活性的影响及其机制，以探讨A O P P 参与A S 发生的可能机制。 方法 我们以内皮细胞株H U E C V 3 0 4 为靶细胞，观察A O P P B S A 对内皮细胞 R O S 生成和细胞活性的影响。 一、无内毒素A O P P B S A 的制备：A O P P B S A 的制备采用W i t k o S a r s a t 等 介绍的方法。将无内毒
9、素B S A 溶液与次氯酸( H O C I ) 分别以1 1 7 0 和1 1 1 4 0 的摩尔比混合，室温放最3 0 m i n ，制备出两种氧化修饰程度不同的 A O P P - B S A ( 1 7 0 、1 1 4 0 ) 。制备的A O P P B S A 在4 0 c 无菌P B S 中透析以 除去游离次氯酸。A O P P 含量测定：以氯胺T 为标准曲线，测定酸性条件 下3 4 0 n t o 的吸光度值。制备的所有A O P P B S A 经鲎试验法测定内毒素。 二、细胞内要R o S 生成量的测定 l 、定性观察：将细胞接种于铺有盖玻片的2 4 孔板并用对R O S
10、敏感的荧 光探针2 ，7 一二氢二氯荧光素( D C F H ) 标记，分别与两种氧化修饰程度 的A O P P - - B S A ( 1 7 0 、1 1 4 0 ) 孵育，同时设P B S 和B S A 细胞对照，1 h 后固定细胞，在荧光显微镜下观察照像。 2 、定量测定：用D C F H 标记细胞，将标记细胞以2 x 1 0 5 孔加入9 6 孔板， 与不同浓度和不同氧化修饰程度的A O P P - - B S A 作用不同时间，用V I C T O R W a l l a c1 4 2 0 多标记分析系统( 美国P E 公司) 在激发光4 8 5 + 1 0 n m 、发射光 5
11、3 5 + 1 0 n m ，3 7 。C 条件下动态测定细胞内氧化D C F H 产生的荧光量的变化， 以此反映R O S 的产生量。 3 、抗氧化剂对A O P P B S A 作用的影响：抗氧化剂P D T C ( 2 0p m o l L ) 、硒 谷胱甘肽过氧化物酶小分子模拟物e b s e l e n ( 1 炉o l L 、5 9 m o l L ) 、N A D P H 氧化酶抑制剂a p o c y n i n ( 5 0 0B m o l L ) 及N O S 抑制剂N - N i t r o L A r g i n i n e ( L - N N A ，5B m o l
12、L ) 预孵育l h ，D C F H 标记细胞，然后用B S A H O C I 摩 尔比为1 1 4 0 的A o P P B S A ( 4 0 0 I t g m 1 ) 刺激细胞l h ，测定细胞内R O S 的产生量，观察其对A O P P B s A 诱导R O S 产生的影响。 三、A O P P 对内皮细胞活性影响的测定 1 、A O P P 对内皮细胞活性的影响的测定：将细胞按i x l 0 4 $ L 接种于9 6 孔 板，贴壁后在无血清培养基中继续培养1 2h 以达到同步，与不同浓度或 不同氧化修饰程度的A O P P B S A 共同培养2 4h ，用M T T 法测
13、定细胞活性， 以P B S 代替A O P P 作为刺激剂培养的对照细胞活性为1 0 0 ，计算A O P P B S A 作用下细胞活性的百分率。 2 、抗氧化剂对A O P P B S A 作用的影响：将细胞与e b s e l e n 预孵育1 h ，然 后再用A O P P B S A ( 1 1 4 0 、8 0 0 9 9 m 1 ) 刺激2 4 h ，用M T T 法测定细胞活性， 观察e b s e l e n 对细胞活性降低的影响。 四、统计方法：实验数据以均值标准误表示，采用S P S S I O 0 统计 软件中的重复测量( r e p e a t e dm e a s
14、u r e s ) 、随机方差分析( o n e w a y A N O v A ) 进行统计学分析。 结果 一、A O P P B S A 的鉴定 经测定体外制备的两种氧化程度的A O P P B S A ( 1 7 0 、1 1 4 0 ) 的A O P P 含量分别为2 2 4 n m o l m g 蛋白质，4 3 3n m o l m g 蛋白质，而未修饰B S A 的A O P P 仅为0 2 n m o l m g 蛋白质；羰基含量分别是1 9 9 4 7 n m o l m g 蛋白 质，2 1 3 0 3n m o l m g 蛋白质和1 1 2 n m o l m g 蛋白
15、质。制各的所有A O P P B S A 经鲎试验法测定内毒素含量低于0 2 5E U m l 。 6 二、A O P P B S A 使内皮细胞R O S 生成增多 1 、定性观察：荧光显微镜下观察显示经A O P P B S A 刺激的细胞荧光 强度较高，P B S 和B S A 对照细胞仅有微弱荧光。 2 、定量测定：细胞内R O S 的生成量随A O P P B S A 刺激时间延长显著增 加，并且与A O P P - - B S A 的浓度和氧化修饰程度相关，而以P B S 或B S A 作 为刺激的对照组细胞内R O S 生成量无明显变化。 3 、用P D T C ( 2 0 u
16、m o l L ) 、e b s e l e n ( 5 9 m o l L ) 、a p o c y n i n ( 5 0 0 p J n o l L ) 、 L - N N A ( 5I _ m o l L ) 预处理细胞，分别使A O P P B S A 诱导产生的R O S 降低 了6 8 、6 7 、2 9 和2 2 ，说明N A D P H 氧化酶和N O S 参与了部分R O S 的生 成，而抗氧化剂可有效清除A O P P 生成的R O S 。 三、A O P P B S A 可使内皮细胞活性下降 1 、A O P P B S A 可使内皮细胞活性显著降低，降低程度与B S A 的氧化修 饰程度及A O P P B S A 的浓度相关，未被氧化的B S A 对细胞活性无明显影响， 说明A O P P 可使细胞活性下降。 2 、用e b s e l e n ( 5 p m o
