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1、山东轻工业学院 硕士学位论文 头孢菌素C高产菌株选育及发酵特性研究 姓名：孟国庆 申请学位级别：硕士 专业：发酵工程 指导教师：刘新利 2011-05-23 山东轻工业学院硕士学位论文 I 摘 要 本论文以头孢菌素 C 产生菌顶头孢霉菌为研究对象， 通过传统理化诱变选育、 复合诱变选育、推理选育及递归原生质体融合（Genome shuffling）技术选育，筛 选头孢菌素 C 高产菌株，并进行相关发酵特性的研究和发酵条件优化实验，为顶 头孢霉工业生产提供了菌株优化改良的实验思路。 首先，以顶头孢霉 ys-3 为出发菌株通过紫外线、亚硝酸及其复合诱变技术进 行菌种的初步优化选育，摸索合适的诱变剂
2、量，确定最佳紫外诱变条件为 30 W 紫 外灯下 15 cm 处照射 120 s，亚硝酸诱变条件为亚硝酸浓度 50 mmol/L，诱变处理 120 s 时为最佳，多轮次诱变积累，共挑选出 879 株诱变子，通过琼脂柱托盘抑菌 高通量筛选，获得了高产菌株 FH-127，较出发菌株抑菌圈直径提高了 80%。 然后，以诱变菌株 FH-127 为出发菌株，根据头孢菌素 C 的生物合成途径，选 择丙二酸、重金属铜离子和头孢菌素 C 钠盐作为筛选耐受压力，确定丙二酸、铜 离子、头孢菌素 C 钠盐浓度分别为 1%、0.06%、8 g/L 时为临界耐受浓度，分别收 集得到铜离子耐受菌株 269 株，丙二酸耐受
3、菌株 187 株，终产物耐受菌株 273 株， 经过琼脂柱托盘抑菌实验初筛， 摇瓶发酵 HPLC 复筛， 获得高产耐受菌株 T-01069、 TB-69068、TBC-68187、TBC-68071，为下一步 Genome shuffling 融合奠定基础。 采用 Genome Shuffling 技术， 对原生质体制备菌龄， 酶解时间及高渗液的选择 进行优化，确定了最佳原生质体制备条件和再生方式，在 30% PEG 6000 介导下对 紫外和加热双亲灭活的原生质体进行融合 10 min，PDA 培养基双层平板再生，并 将所得的性状优良突变株进行递归融合选育，琼脂柱抑菌筛选并通过 HPLC 检
4、测， 将选育出的多优良性状进行整合，获得高产融合子 G4-13，且比原始菌株产量提高 101.4%。 在对最终筛选出的高产菌株遗传稳定性实验后，还研究了该菌株的发酵特性， 首先分析了发酵过程中菌株对豆油的利用能力，降低了豆油添加量。随后对豆油 进行了硅胶柱层析，初步分为极性、中极性和弱极性组分，通过比较发现中弱极 性的组分更有利于头孢菌素的合成。接下来还进行了发酵环境的优化实验，分别 对其进行接种菌龄、发酵周期及发酵温度优化实验，最终确定最佳优化条件为： 接种膨大菌丝阶段时期菌种， 控制发酵温度前期 28 ， 后期 25 ， 发酵 136 h 后， 此条件 HPLC 检测头孢菌素 C 的含量最
5、大。通过发酵特性优化实验，最终减短顶 头孢霉发酵周期， 降低生产头孢菌素 C 发酵过程中的豆油添加量和动力高耗问题， 为大规模的工业生产降低成本提供很好的实验依据。 关键词：关键词：顶头孢霉；头孢菌素 C；推理选育；原生质体融合；Genome shuffling 山东轻工业学院硕士学位论文 I ABSTRACT In this article, Physical chemical mutation, retional screening and genome shuffling techniques were used to improve the production of cephalos
6、porin C by Acremonium chrysogenum ys-3 and got a high-producing strain G4-13. Then we analyzed its characteristics of fermentation, which provided some useful ideas in strain optimiziation. First, the strain Acremonium chrysogenum ys-3 was mutated by UV and nitrous in following condition: 30 W, 15 c
7、m and 120 s in UV mutagenesis and 50 mmol/L, 120 s in nitrous mutagenesis. Then the two methods for a complex mutagenesis were combined, and 879 mutations were screened through the agar column tray high-throughput method. Finally a best strain FH-127 was got, whose production increased 80% than the
8、origin. Then FH-127 was performed to mutated with rational screening by malonic acid(1%), heavy metal copper ions(0.06%) and cephalosporin C sodium salt(8 g/L) as selection pressure which were choose by the biosynthesis pathway analysis. In this period, 187 strains were screened under 1% malonic aci
9、d pressre, 269 under copper ions and 273 strains under CPC. After the agar column tray high-throughput screening, T-01069, TB-69068, TBC-68187, TBC-68071 were obtained, which could be used in the following Genome shuffling. The cell phase, enzymolysis duration and the hypotonic solution were firstly
10、 optimized in protoplast preparation. After killing the parental strains by heat and UV, the cells were fused with 30% PEG 6000 as inducer for 10 min. fusants were regenerated on PDA agar and mixed as multiparental strains for several subsequent shuffling. Finally, a high CPC producing strain G4-13
11、was got, whose yield than the origin. After genetic stability experiment of the final selected high-yield strains, its fermentation characteristic was analyzed, and the addition of soybean oil was reduced. Results of further research showed that weakly polar fractions of soybean oil showed more rela
12、tively with the CPC yield. Then we optimized its fermentation which shorttened the fermentation cycle and reduced the soybean oil addtion. Our work supplied some useful ideas for industrial application. Key words: Acremonium chrysogenum, cephalosporin C, retianal screening, protoplast fusion, Genome
13、 shuffling 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的
14、复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名： 日期： 年 月 日 1 第 1 章 绪 论 1.1 头孢菌素 C 及其产生菌 1.1.1 头孢菌素概述 头孢菌素又称先锋霉素，属于 -内酰胺类抗生素，广泛应用于半合成头 孢类抗生素中。自上世纪 60 年代，头孢类抗生素产品开始问世，目前上市的 品种已有 60 多种。头孢类抗生素产量现已占世界抗生素产量的 60%以上，是 一类被广泛使用的抗生素。 头孢菌素化合物最初发现于1948年， 是由意大利科学家Giuseppe Brot
15、zu从地中 海萨丁岛排水沟中的顶头孢霉菌中研究其拮抗性时提炼出来的。他发现这些顶头 孢霉菌分泌出的一些物质，可以有效抵抗引致伤寒的伤寒杆菌1。牛津大学的 Newton & Abraham于1955年成功提炼出对-内酰胺酶稳定的头孢菌素C （cephalosporin C） ，但却未有足够的效力作临床使用2。 头孢菌素 C，全称 7-(D-5-氨基-5-羧基戊酰胺基)头孢霉烷酸，是一种亲水性的 -内酰胺类抗生素，分子量为 415.4，分子式为 C16H21O6N3S，头孢菌素 C 钠盐中 含两个结晶水，为淡黄色或白色的结晶粉末，有很强的水溶性，易潮解，受热也 易分解，能微溶于乙醚3。 头孢菌素
16、C 的分子结构式如图 1.1 所示。 N S O OHO H O O NH HO O O NH2 图 1.1 7-(D-5-氨基-5-羧基戊酰胺基)头孢霉烷酸4 Figure 1.1 7-(D-5-amino-5-carboxyvaleramido) cephalosporanic acid 头孢菌素C是继青霉素之后发现的又一类重要的-内酰胺类抗生素。 其核心7- 氨基头孢烷酸（简称7-ACA） ，是从头孢菌素C中衍生出来的，并已证实与青霉素 的核心6-氨基青霉烷酸（6-APA）相似。都是属于繁殖期杀菌药，通过改变细胞膜 第 4 章 顶头孢霉的 Genome shuffling 2 的通透性，抑制蛋白质的合成，并释放出自溶素5。与青霉素相比，
