hiv1感染者+cd8t+细胞中+toll+样受体的表达及免疫功能研究

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1、 HIV-1 感染者CD8+T 细胞中Toll 样受体 的表达及免疫功能研究 ? 宋宋宋宋 扬扬扬扬 ? ? 孙永涛孙永涛孙永涛孙永涛 教授教授教授教授 ? 第四军医大学第四军医大学第四军医大学第四军医大学唐都医院传染科唐都医院传染科唐都医院传染科唐都医院传染科 博士博士博士博士 ? 内内内内科学科学科学科学（传染病传染病传染病传染病） 2008.04 2008.05 ! 2005 年年年年 9 月至月至月至月至 2008 年年年年 3 月月月月 #$ 第四军医大学第四军医大学第四军医大学第四军医大学 独独独独独独独独 创创创创创创创创 性性性性性性性性 声声声声声声声声 明明明明明明明明 秉

2、承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 日期： 保保保保保保保保 护护护护护护护护 知知知知知知知知 识识识识识识识识 产产产产产产产产 权权权权权权权权 声声声声声声声声 明明明明明明明明 本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定

3、，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外） ，可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。 论文作者签名： 导师签名： 日期： HIV-1 感染者感染者感染者感染者CD8+T 细胞中细胞中细胞中细胞中Toll 样受体样受体样受体样受体 的表达及免疫功能研究的表达及免疫功能研究的表达及免疫功能研究的表达及免疫功能研究 研 究 生：宋 扬 学科专业：内科学（传染病） 所在单

4、位：第四军医大学唐都医院传染科 导 师：孙永涛 教 授 辅导教师：康文臻 副教授 资助基金项目：973 项目（2006CB504204） 关键词：I 型人类免疫缺陷病毒；获得性免疫缺陷综合征； CD8+T 细胞；Toll 样受体-7；细胞内细胞因子染色 中国人民解放军第四军医大学 2008 年 05 月%&()*+,*-./ 目目目目 录录录录 缩略语表 1 中文摘要 5 英文摘要 9 前 言 13 文献回顾 14 正 文 45 实验一 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞中 TLRS表达的研究 45 1 材料 45 2 方法 48 3 结果 54 4 讨论 59 实验二 TLR7 配体诱导

5、CD8+T 细胞活化及细胞因子产生 61 1 材料 61 2 方法 62 3 结果 65 4 讨论 72 小 结 75 参考文献 76 个人简历和研究成果 93 致 谢 94 %&()*+,*-./ 010 缩略语表缩略语表缩略语表缩略语表 缩略词缩略词缩略词缩略词 英文全称英文全称英文全称英文全称 中文全称中文全称中文全称中文全称 AIDS acquired immunodeficiency syndrome 123456789:(;?ABC CAF cell antiviral factor BC=DEF CK cytokine BCEF CpG DNA unmethylated CpG

6、DNA GHIJKCLM-NOPQRSIT CTL(Tc) cytotoxic T lymphocytes BCDTUVBC DC dendfitic cell WXYBC DEPC diethyl pyrocarbonate ZI_ DMSO dimethyl sulfoxide ZHIa DNA deoxyribonucleic acid bcQdQS dsRNA double-stranded RNA efRNA ECSIT evolutionarily conservedintermediate in theToll pathway gJhijKTollklhmn EDTA ethyl

7、ene diamine tetraacetic acid Z_&S Env Envelope opq FADD Fas-associated death domain protein rstpq FCM flow cytometry uvBCw FCS fetal calf serum xyz %&()*+,*-./ 020缩略词缩略词缩略词缩略词 英文全称英文全称英文全称英文全称 中文全称中文全称中文全称中文全称 Fig Figure | FITC fluorescent isothiocyante S Gag Group specific antigen ? GAPDH glycerald

8、ehydes phosphate dehydroge- nase Sb gp glycoprotein dpq gp41 glycoprotein 41 dpqgp41 gp120 glycoprotein 120 dpqgp120 h hour HAART highly active antiretroviral therapy =D HEPES N-2-hydroxyethylpiperazine-N -2-ethanesulfonicacid N-2 I-N-2S HIV-1 human immunodeficiency virus type I I 4567=D HSP Heat sh

9、ock protein pq ICS intracellular cytokines staining BCBCEF IFN- interferon- IFN- interferon- IFN- interferon- IL interleukin IRAK IL-1 receptor associated kinase IL-1 IRF-3 interferon regulate factor-3 -3 LBP Lipoplolysaccharide binding protein 3缩略词缩略词缩略词缩略词 英文全称英文全称英文全称英文全称 中文全称中文全称中文全称中文全称 LPS lip

10、opolysaccharide LRR Leucine rich repeat LTR long terminal repeat MAPK mitogen-activated protein kinases MHC major histocompatibility complex min minute MyD88 myeloid differentiation factor 88 88 Nef Negative factor NK natural killer cell NO nitrogen monoxide PAMP pathogen-associated molecular patter

11、n PBMC peripheral blood mononuclear cell PBS phosphate-buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction Pol Polymerase PRR pattern recognition receptor Rev Regulator of expression of viral proteins RNA Ribonucleic Acid rpm rounds per minute ? RSV respiratory syncytial virus ? 4缩略词缩略词缩略词缩略词 英文全称英文全称英文全称

12、英文全称 中文全称中文全称中文全称中文全称 RT-PCR Reverse Transcriptase PCR ?- sec second ? SIV simian immunodeficiency virus ? ssRNA single-stranded RNA RNA Tab Table Tat Transactivitor Th T helper cell T THD Toll homologydomain Toll TIR Toll/IL-1 receptor homologous region Toll/-1 TLRs Toll-like receptors Toll TNF- tu

13、mor necrosis factor- TRAF6 TNF receptor associated factor 6 -6 TRAM TRIF-related adaptor molecule TRIF TRIF Toll/IL1 receptor domaincontaining adaptor inducing IFNbeta TIR l microliter Vif Virion infectivity factor Vpr Viral protein R R Vpu Viral protein U U 5 HIV-1 感染者感染者感染者感染者 CD8+T 细胞中细胞中细胞中细胞中 T

14、oll 样受体样受体样受体样受体 的表达及免疫功能研究的表达及免疫功能研究的表达及免疫功能研究的表达及免疫功能研究 博博博博士研究生士研究生士研究生士研究生 ：宋宋宋宋 扬扬扬扬 导导导导 师师师师 ：孙永涛孙永涛孙永涛孙永涛 教授教授教授教授 第四军医大学第四军医大学第四军医大学第四军医大学唐都唐都唐都唐都医院医院医院医院传染传染传染传染科科科科，西安西安西安西安 710038 中文摘要中文摘要中文摘要中文摘要 【背景背景背景背景】 获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS） ，简称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒（human imm

15、unodeficiency virus，HIV）引起的致命性慢性传染病。研究显示 CD8+T 细胞在控制 HIV-1 感染中起重要作用。它所介导的 CTLs 反应是机体针对 HIV-1 感染最有力的效应武器，但其具体机制尚未完全阐明。Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）作为联系固有免疫与适应性免疫系统的桥梁，可特异性的识别病原微生物，偶联信号转导途径， 从而诱导特异性基因的表达和细胞因子/趋化因子的分泌， 在机体抗感染免疫中发挥重要作用。已有研究提示 TLRs 与 HIV-1 感染密切相关。但 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞与 TLRs 之间的关系尚未见报

16、道。因此，本课题主要采用实时定量 PCR（real-time PCR）法、流式细胞术及细胞内因子染色（intracellular cytokines staining,ICS）等技术分析了 31 例 HIV-1 感染者和 20 例正常人 CD8+T 细胞中 TLR4、TLR5 和 TLR7 的表达，以筛选出表达 6异常的 TLR，并探讨其功能，从而为揭示 HIV-1 感染过程中 TLR 的作用、确定抗病毒药物的研制靶点及提供新的疫苗候选分子打下坚实的实验基础。 【目的目的目的目的】 1. 筛选 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞中表达异常的 TLR；2. 研究 TLR 表达与CD4+T 细胞

17、计数、HIV-1 病毒载量及 HAART 治疗的关系，探讨其在 HIV-1感染过程中的意义；3. 研究 TLR 配体对 CD8+T 细胞的激活作用及 CD8+T细胞分泌细胞因子的情况，以了解 HIV-1 感染过程中 TLR 的功能及辅助因子在其中的作用。 【方法方法方法方法】 1. 使用富集 CD8+T 细胞抗体混合物从人外周血中分离 CD8+T 细胞，采用实时定量 PCR 法筛选 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞中表达异常的 TLRmRNA，TLRmRNA 的相对表达量通过 2-Ct法计算，随后采用流式细胞术在蛋白水平验证 TLR 的表达差异；2. 采用流式细胞术和实时荧光定量 PCR

18、法检测HIV-1 感染者 CD4+T 细胞计数及病毒载量， 通过统计学方法分析表达异常的TLR 与 CD4+T 细胞计数、病毒载量及 HAART 治疗的关系；3. 采用密度梯度分离法从人外周血中分离 PBMC，随后通过流式细胞术检测不同浓度的TLR7 配体（0.5、1 和 5g/ml）刺激 6h 后，纯化 CD8+T 细胞和 PBMC 中CD8+T 细胞表面 CD69 的表达； 4. 应用细胞内细胞因子染色技术检测不同浓度的 TLR7 配体（0.5、1 和 5g/ml）刺激 6h 及 20h 后，纯化 CD8+T 细胞和PBMC 中 CD8+T 细胞分泌 IL-2 和 IFN- 的情况。 【结

19、果结果结果结果】 1. 实时定量 PCR 法检测 HIV-1 感染者和正常人 CD8+T 细胞中 TLR4、 TLR5和 TLR7 的表达，结果显示，HIV-1 感染者 CD8+T 细胞中均有 TLR4、TLR5和 TLR7mRNA 的表达，其中 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞中 TLR7mRNA 的表达显著升高 （P0.05） 。为进一步证实 TLR7 的表达差异，采用流式细胞术检测了 HIV-1 感染者和正 !#$%&%()* +7+常人 CD8+T 淋巴细胞中 TLR7 蛋白的表达，结果显示 HIV-1 感染者 CD8+T细胞中 TLR7 蛋白的表达亦显著升高（P0.05） 。根据

20、 CD4+T 细胞计数 （200cells/l 和105copies/ml和0.05） ； 2. 不同浓度（0.5、1 和 5g/ml）的 TLR7 配体 CL097 刺激纯化 CD8+T 细胞和 PBMC 6h 后，用流式细胞术检测 CD8+T 细胞表面 CD69 的表达水平，结果显示 HIV-1 感染者和正常人纯化 CD8+T 细胞表面 CD69 的表达均增高（P0.05） ，并且 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞表面 CD69 的表达显著高于其在正常人中的表达（P0.05） 。此外，HIV-1 感染者 PBMC 中 CD8+T 细胞表面CD69 的表达也显著增高（P0.05） 。并且

21、 CD69 在 CD8+T 细胞表面的表达呈浓度依赖性，CL097 在浓度为 0.5g/ml 时，CD8+T 细胞表面 CD69 的表达最高； 3. 不同浓度（0.5、1 和 5g/ml）的 TLR7 配体刺激纯化 CD8+T 细胞 6h 后，采用细胞内细胞因子染色法检测 CD8+T 细胞分泌 IL-2 和 IFN- 的情况。结果显示 HIV-1 感染者和正常人 CD8+T 细胞均未产生 IL-2 和 IFN-。 延长孵育时间至 20 小时，仍未见 IL-2 和 IFN- 的产生。不同浓度的 TLR7 配体（0.5、1 和 5g/ml）刺激 HIV-1 感染者 PBMC 6 小时后，用细胞内细

22、胞因子染色法检测 CD8+T 细胞内 IL-2 和 IFN- 的分泌情况，同样未产生 IL-2 和 IFN-。延长孵育时间至 20 小时，发现 CD8+T 细胞可产生 IFN-（P0.05） ，但未见IL-2 的产生。此外，HIV-1 感染者 PBMC 中 CD8+T 细胞 IFN- 的产生呈浓度依赖性，CL097 在浓度为 1g/ml 时，CD8+T 细胞产生的 IFN- 最多。 【结论结论结论结论】 1. CD8+T 细胞可表达 TLR4、TLR5 和 TLR7。但 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞中 TLR7 的表达显著升高，提示 HIV-1 感染的发生、发展可能与 TLR7 有一

23、!#$%&%()* +8+定关系；2. TLR7 配体可显著上调 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞表面 CD69 的表达，但与 PBMC 中 CD8+T 细胞表面 CD69 的表达无显著差异，提示 TLR7信号与 HIV-1 感染过程中的免疫激活有一定关系， 但不依赖于辅助因子的参与；3. ICS 检测发现 TLR7 配体虽不能刺激纯化 CD8+T 细胞分泌细胞因子，但 PBMC 中的 CD8+T 细胞可在其诱导下产生 IFN-， 提示 TLR7 信号可诱生HIV-1 感染者 CD8+T 细胞抗病毒分子的产生，但需要辅助因子的参与。这一研究可能为深入揭示 HIV-1 的免疫应答机制及其分子

24、基础、 选择新的药物治疗靶点和疫苗设计提供新思路。 【关键词关键词关键词关键词】 I 型人类免疫缺陷病毒；获得性免疫缺陷综合征；CD8+T 细胞；Toll样受体-7；细胞内细胞因子染色 !#$%&%()* +9+ TLRs Expression and Immune Function in CD8+T cells in HIV-1 Infection Candidate for Ph.D: Song Yang Supervisor: Prof. Sun Yongtao Department of Infectious Diseases，Tangdu Hospital， Fourth Milit

25、ary Medical University，Xian 710038，China Abstract 【Background】 Acquired immunodeficiency syndrome(AIDS) is a chronic infectious disease caused by human immunodeficiency virus(HIV). CD8+ T cells play a crucial role in the control of HIV-1 viremia. However, the underlying mechanisms are not fully unde

26、rstood. Toll-like receptors(TLRs), which can link innate immune responses and adaptive immune responses, activate signal transduction pathway in cells and lead to cytokines secretion. This is considered as the first barrier of host to defense the invading pathogens. Previous studies showed that TLRs

27、 are significantly related to HIV-1 infection. However, no studied are available regarding expression of TLRs on CD8+ T cells in HIV-1 infection. In this study, we examined the expression of TLR4,TLR5 and TLR7 on CD8+ T cells from 31 HIV-1 infected individuals and 20 healthy controls. TLRs expressed

28、 abnormally were screened out and follow-up verification and functional studies were carried out to elucidate the role of TLRs on CD8+ T cells !#$%&%()* +10+ in HIV-1 infection, and provide solid experimental basis for the development of novel targets for the design of vaccine and medicine. 【Objecti

29、ves】 1. To screen out the TLRs expressed abnormally on CD8+T cells in HIV-1 infection; 2. To analyze the relationships between TLRs expression and CD4+T cells counts, HIV plasma viral loads and HAART; 3. To explore the function of TLR ligand on activation of CD8+ T cells. 【Methods】 1. Human CD8+ T c

30、ell Enrichment Cocktail was used for the purifying of CD8+ T cells.The expression of TLRs was analyzed by real-time PCR and flow cytometry; 2. CD4+ T cell counts and HIV viral load were determined by real-time PCR and flow cytometry. Statistic analyses were explored to value the correlation of TLRs

31、expression and CD4+ T cells counts, HIV viral loads and HAART; 3. Fresh PBMCs were separated from whole blood by Ficoll-Hypaque (Sigma) density gradient centrifugation. The expression of CD69 after stimulation of CD8+ T cells with TLR7 ligand （0.5, 1 and 5g/ml） for 6hr was analyzed by flow cytometry

32、; 4. To explore the cytokine(IL-2,IFN-) secretion by CD8+ T cells, ICS was used after stimulation with TLR7 ligand（0.5, 1 and 5g/ml）for 6hr and 20hr. 【Results】 1. To examine the expression levels of TLR4, TLR5 and TLR7 during HIV-1 infection, we sorted CD8+ T cells from HIV-1 infected individuals an

33、d healthy volunteers and evaluated TLR-specific mRNA in CD8+ T cells by QRT-PCR. We observed that TLR4, TLR5 and TLR7 mRNA were detected across both populations. Compared with 20 healthy volunteers, 31 HIV-1 infected individuals had significantly increased TLR7 mRNA expression in freshly isolated CD

34、8+ T cell(P0.05). To further confirm the enhanced expression of TLR7 in CD8+ T cells in HIV-1 infected individuals, we examined the TLR7 expression at protein level in CD8+ T cells by flow cytometry. 31 HIV-1 infected individuals had significantly increased TLR7 protein expression in freshly isolate

35、d CD8+ T cells compared with 20 healthy volunteers(P200cells/l or 105copies/ml or 105copies/ml), no differences in TLR4, TLR5 and TLR7 expression were observed. 2. To assess whether treatment with TLR7 ligand can increase immune activation of CD8+ T cells in HIV-1 infected individuals, we analyzed C

36、D69 expression on purified CD8+ T cells, which is considered as early activation state marker after exposure to tested stimuli. Although following stimulation of CD8+ T cells with TLR7 ligand, CD69 expression on CD8+ T cells was significantly increased in HIV-1 infected individuals and healthy group

37、 at concentration of 0.5, 1 and 5g/ml, the increase of CD69 was more significant in HIV-1 infected group(P0.05). !#$%&%()* +12+ 3. To examine whether the differences in TLR7 expression could have functional consequences, we analyzed the effect of CL097 at concentration of 0.5, 1 and 5g/ml on IL-2 an

38、d IFN- production by CD8+T cells from HIV-1 infected individuals and healthy control subjects. After 6hr and 20hr incubation with CL097, purified CD8+ T cells from two groups did not produce cytokines (IL-2 and IFN-) significantly as assessed by intracellular cytokine staining. We subsequently studi

39、ed cytokine-secretion of CD8+ T cells following stimulation of PBMC with TLR7 ligand at concentrations of 0.5, 1 and 5g/ml. After 6hr incubation, CD8+ T cells from HIV-1 infected individuals did not produce IFN- and IL-2. However, we observed that TLR7 ligand up-regulated IFN- production by CD8+T ce

40、lls and failed to modulate IL-2 production after 20hr incubation. The effects of TLR7 ligand on IFN- production was dose dependent and maximal at concentration of 1g/ml. 【Conclusions】 1. CD8+ T cells could express TLR4, TLR5 and TLR7. TLR7 expression in freshly isolated CD8+ T cells was significantl

41、y increased in HIV-1 infected individuals compared with healthy volunteers, which suggests that TLR7 may relate to HIV-1 infection. 2. TLR7 ligand can change the activation status of CD8+T cells from HIV-1 infected individuals. 3. TLR7 ligand can induce significant IFN- secretion in CD8+ T cells in

42、an accessory cell-dependent manner during HIV-1 infection. Key words：HIV-1;AIDS;CD8+ T cell;TLR7;ICS !#$%&%()* +13+ 前前前前 言言言言 艾滋病是严重影响人类生命安全的传染病之一。目前，全世界累计已有7千万人感染HIV-1，2千万人死亡，其中95%以上的病例出现在发展中国家。近年来，我国HIV-1感染的人数日益增多。截止2007年底，我国现存艾滋病病毒感染者和病人约为70万(5585万人)，其中艾滋病病人8.5万(89万人)1。高效抗逆转录病毒治疗（HAART）虽能降低部分患者的病

43、毒载量、延缓病情发展、 改善症状， 但不能完全清除患者体内的病毒。 因此， 探讨HIV-1感染发生、发展的分子机制，了解机体抗病毒感染的免疫机制，寻找有效的抗病毒药物、研发HIV-1疫苗是目前迫切需要解决的问题。 人体感染HIV数年后才可能进展为艾滋病，在这期间机体的各种免疫应答能抑制HIV的复制，其中包括中和抗体的产生，抗体依赖补体介导的细胞毒作用，T淋巴细胞介导的细胞毒作用及NK细胞介导的细胞毒作用等。大量研究证明，细胞免疫特别是HIV特异性CD8+T细胞在控制HIV感染中起关键作用，但其具体机制尚未完全阐明。 众所周知，固有免疫和适应性免疫反应是机体清除外来微生物的主要途径。TLRs 是

44、新近发现的、在机体抗病毒免疫调节中起重要作用的模式识别受体，它在固有免疫细胞和适应性免疫细胞中均有表达。TLRs 可识别病原微生物的病原相关分子模式，通过不同的信号转导途径，介导机体的免疫应答。研究发现 CD8+T 细胞可表达 TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和 TLR9。但 HIV-1 感染过程中 TLRs 与 CD8+T 细胞的关系尚不十分清楚。因此， 探讨 HIV-1 感染过程中 CD8+T 细胞 TLRs 的表达特点及其介导的免疫反应，将有助于了解 HIV-1 免疫应答的分子机制，并为抗病毒药物的设计和疫苗研发奠定基础。 !#$%&%()* +14+ 文献回顾

45、文献回顾文献回顾文献回顾 1HIV-1 病毒的病毒的病毒的病毒的生物学特性生物学特性生物学特性生物学特性和和和和 AIDS 的的的的流行现状流行现状流行现状流行现状 1.1 HIV-1病毒的生物学特性病毒的生物学特性病毒的生物学特性病毒的生物学特性 人类免疫缺陷病毒属于逆转录病毒科，慢病毒亚科，是单链RNA病毒。目前已知HIV有两个型，即HIV-1和HIV-2，两者均能引起艾滋病。在HIV-1和HIV-2两型之间，其核苷酸序列只有45%的同源性。HIV-1对人的致病性、传染性、机体复制能力、母婴传播机率、引起临床症状的严重程度均比后者强。HIV-2目前仅发现在西非部分地区流行，全球绝大部分患者

46、或感染者均由HIV-1型引起。 在HIV-1型内，根据编码包膜蛋白的env基因和编码壳蛋白的gag基因序列的同源性又进一步分为三个组：M组（main即主要组）、O组（outline即外围组）和N组（new，or non-M，non-O新组或非M非O组），M组内又可分为A-J10个亚型。在HIV-1型内，各亚型之间的基因离散率是20-35%、同一亚型内的基因离散率是7-20%。O组是1990年从喀麦隆和加蓬分离到的，与M组其它亚型的氨基酸序列只有50%的同源性。N组是近期从两名喀麦隆病人体内分离得到的，在系统树上，既不属于M组，也不属于O组，故称N组。不同国家和地区各有其优势亚型2。成熟的HIV

47、-1病毒颗粒在电镜下呈球形，类似20面体结构， 直径约90-140nm， 病毒颗粒外层是由脂双层膜构成的被膜，也称外膜或包膜，其外面有突起，由外膜糖蛋白gpl20和gp41构成，插入被膜中的称为跨膜糖蛋白，主要由gp41组成，而gpl20是主要的包膜糖蛋白，在病毒吸附与穿入靶细胞过程中起重要作用，gp41也参与这一过程。被膜内面为Gagp18/Gagp17蛋白构成的核壳， 其内为GagP24蛋白， 由它包裹着核心蛋白、酶类及作为基因组的两条RNA（图1）。 !#$%&%()* +15+ ,1 HIV -./0-./0-./0-./0 Fig.1 Viral particle HIV的基因组全长

48、大约有9.7kb。 在其两端是相同序列而又不转录的长末端重复序列（long terminal repeat，LTR）。从5末端的LTR之后，依次含有gag、pol和env三个主要基因。这三个主要基因为所有逆转录病毒所共有。而HIV所特有的是含有tat和rev两个调节基因，以及vif，nef，vpr，vpu，vpx等附属基因。其中vpu为HIV-1所特有，而vpx为HIV-2所特有。主要的转录物为一全长的mRNA，以这一mRNA为模板，编码主要的结构蛋白质如Gag和Gag-Pol融合蛋白。Gag（p55）被蛋白酶进一步裂解成p17、p24、p7、p6以及p1和p2蛋白质。而Pol蛋白质会进一步被

49、裂解成蛋白酶、逆转录酶和整合酶。其他蛋白质，包括包膜蛋白gp160、Tat、Rev、Vif、Nef、Vpr、Vpu以及Vpx，则是从被进一步剪接的各类mRNA编码而来（图2）。 !#$%&%()* +16+ ,2 HIV-1 -.123-.123-.123-.123 Fig.2 HIV-1 genome 目前，有关HIV的致病机理还不十分清楚。一般认为，HIV感染CD4+ T细胞后，病毒通过基因组整合，以前病毒形式存在于CD4+T细胞中；在感染的早期，Th1细胞分泌IL-2和IFN-等细胞因子，刺激CD8+T淋巴细胞对感染病毒的CD4+T细胞产生强大的免疫抑制作用，从而使病毒处于被抑制的潜伏状

50、态。在感染的晚期，Th2细胞的分泌占优势，通过分泌IL-10等细胞因子，使CD8+T细胞失去对CD4+T细胞的抑制，病毒增殖并释放出新的病毒颗粒去感染更多的CD4+T细胞，从而造成CD4+T细胞的大量死亡，最后耗竭而失去其免疫功能3。 巨噬细胞处于防御和控制感染的中心环节，可直接消灭入侵的病原体，或通过分泌细胞因子活化其它先天防御体系而产生适当的免疫应答。在HIV-1感染中，巨噬细胞被认为发挥着两种意义上的作用，一是作为抗病毒防御系统， 另是作为靶细胞。 由于巨噬细胞能适应不断改变的细胞因子环境，这使得巨噬细胞的特殊功能表型占有优势，从而在HIV的发病机理中扮演着重要角色。 有研究4比较了未处

51、理的 （M0） 和从有IFN-活性的单核细胞 （M1）中分离得到的巨噬细胞在HIV-1传播中的作用，显示M0和M1结合HIV-1的效力相同， 在R5-HIV附着中发挥C型外源凝集素的作用， 而在X4-HIV附着中发挥硫酸肝素蛋白多糖的优势作用。尽管R5-和X4- HIV DNA水平相似，但M1可以通过释放CXCR4-和CCR5-相关的趋化因子，复制并微弱地传送病毒到激活的T细胞中去。用mAb封闭M1上表达的树突状细胞专一性ICAM-3-G非 !#$%&%()* +17+ 整联蛋白后，发现病毒传递未受干扰。未感染的M1可以有效补充HIV易感T细胞，并能释放可溶因子、增加病毒复制。这项研究发现：在

52、诱导巨噬细胞种群方面，IFN-发挥着重要作用，它能使HIV-1处于一个潜伏阶段，并通过及时补充T细胞或增强感染的CD44T细胞中病毒复制的水平，使病毒持久存在。 许多研究表明，一些细胞因子和其他病毒感染，能激活HIV的复制和表达，有报道认为糖皮质激素和白介素（IL-4，IL-6和IL-10等细胞因子）能协同增强HIV的复制。其他病毒的各种基因产物能促进HIV高水平复制，而且有些病毒还能和HIV-1协同破坏CD4+T淋巴细胞。AIDS晚期CD44T细胞明显衰竭时，巨噬细胞可作为病毒复制的场所。此外，抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）或趋化细胞因子与CD4+T细

53、胞间的相互作用，可引起细胞内的病毒传递。所以在临床上AIDS患者常常合并感染巨细胞病毒5、疱疹病毒、EB病毒、TB6-8、寄生虫9等，并促使病情恶化。 1.2 AIDS 的流行现状的流行现状的流行现状的流行现状 自美国 1981 年诊断出首例艾滋病患者以来，艾滋病病毒以惊人的传播速度在全球范围内迅速扩散。 根据联合国艾滋病规划署和世界卫生组织 2007年 12 月共同发布的2007 年世界艾滋病报告1，2007 年全球新增艾滋病病毒感染者 250 万，使现存艾滋病病毒感染者总数达到 3320 万，同时全球在 2007 年内又有 210 万人死于艾滋病 （图 3） ， 其中每天有 6800 人感

54、染 HIV，同时每天有 5700 名感染者死亡。从艾滋病病毒感染者的分布状况来看，撒哈拉以南非洲地区仍是艾滋病重灾区， 全球 63的艾滋病病毒感染者集中在这里。 2007 年该地区新增艾滋病病毒感染者 170 万， 占全球新增感染者总数的 68%，总感染人数达 2250 万。此外，拉美地区也是目前受艾滋病影响最严重的地区之一。截至 2007 年底，该地区的艾滋病病毒感染者总数为 160万，成人艾滋病病毒感染率达 0.5%。截止 2007 年底，整个亚洲的艾滋病病毒感染者达 490 万，其中新增感染者 44 万，30 万艾滋病患者死亡。仅东南 !#$%&%()* +18+ 亚及南亚地区的艾滋病病

55、毒感染者总数已达到 400 万，其中新增感染者 34万。目前，东欧和中亚地区是艾滋病病毒感染者增加最快的地区，2007 年的感染人数达 160 万，比 2001 年增加了 100 万。 ,3 20075555HIV-16789:;?6789:;?6789:;?6789:;?AAAABCBCBCBCDDDD2007EFGHIJKLEFGHIJKLEFGHIJKLEFGHIJKLMNMNMNMN Fig. 3 Adults and children estimated to be living with HIV-1 in 2007 (from AIDS epidemic update: Decem

56、ber 2007) 自 1985 年首次发现艾滋病感染病例后，艾滋病在中国的流行经历了传入期、播散期和增长期三个阶段。1985-1988 年为散发期，此期间全国报告OPQRSTUVTWXY Z19Z 了 19 例 HIV 感染者，散在分布于沿海的一些大城市，多为外籍公民和少数因为应用被污染的进口血制品而感染的中国居民。1989-1994 年则转入了局部流行期，1989 年 10 月在云南西南边境瑞丽市吸毒人群中发现 146 例 HIV感染者，此后在德宏州的几个市、县出现了局部流行，吸毒者中 HIV 感染率为 23.1%。1992 年对 200 多万高危人群检测，发现艾滋病病人及感染者为932

57、例，分布于 16 个省市。广东、福建、海南、湖南等省发现的 HIV 感染者多是在泰国感染后归国，经过性行为感染的。此阶段艾滋病的传播方式以静脉吸毒为主，其次是性传播。1995 年至今已发展为广泛流行期，此期间全国报道的 HIV-1 感染人数迅速上升。 到 1998 年全国 31 个省均有检出 HIV 感染者， 但疫情仍相对集中在一些省的某些地区的某类人群。 在 1985 年至 2000年底的 15 年间，中国累计报告的发病人数和死亡人数分别为 880 例和 496例，而 2001 年和 2002 年两年合计报告的艾滋病发病人数和死亡人数分别为1742 例和 716 例，2002 年报告艾滋病病

58、例数比 2001 年增长了 44。2007年 11 月 29 日，卫生部、联合国艾滋病规划署和世界卫生组织联合宣布，根据最新评估结果，到 2007 年底，我国现存艾滋病病毒感染者和病人约 70 万（55-85 万）人，全人群感染率为 0.05（0.04-0.07） 。其中艾滋病病人8.5 万（8-9 万）人；2007 年新发艾滋病病毒感染者 5 万（4-6 万）人，因艾滋病死亡的有 2 万（1.5-2.5 万） 。5 万例新发 HIV 感染者主要发生在吸毒、卖淫嫖娼、男男性行为等高危行为的人群和感染者的性伴人群中。其中，异性性传播的占 44.7%，男男性传播的占 12.2%，注射吸毒传播占 4

59、2%，母婴传播占 1.1%。目前我国艾滋病疫情处于总体低流行、特定人群和局部地区高流行的态势。有四大特点：1、艾滋病疫情上升速度有所减缓；2、性传播逐渐成为主要传播途径；3、艾滋病疫情地区分布差异大；4、艾滋病流行因素广泛存在。 OPQRSTUVTWXY Z20Z 2. CD8+T 细胞在控制细胞在控制细胞在控制细胞在控制 HIV-1 感染中的作用感染中的作用感染中的作用感染中的作用 病毒特异性CD8+T细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)从HIV-1急性感染期开始似乎就同遏制病毒复制有密切关系。CD8+T 淋巴细胞在急性 HIV 感染时能快速扩增，这些 T 淋巴细胞

60、分别针对病毒基因的结构区和调节区，感染后几周内外周血中 HIV 特异性 CD8+T 细胞显著增加，且增加的幅度与体内早期病毒载量的下降密切相关10。 CD8+T 细胞应答的幅度对控制病毒复制非常重要，若感染者 CD8+T 细胞应答局限于少数病毒基因产物，通常会出现病毒的持续复制和疾病的快速进展 ；在猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)感染猕猴的实验中发现，缺失 CD8+T 细胞的感染者很快发展为 AIDS，如果存在强特异性 CD8+T 细胞应答，则可清除体内SIV11。对慢性 HIV 感染者的研究发现 CD8+T 细胞对控制病毒复制和延缓疾病进展

61、起重要作用12，Gag 特异性 CD8+T 细胞应答同 HIV-1 病毒载量呈负相关13。而长期无进展者有强大的、特异性 CD8+T 细胞应答和较低的病毒载量14,15。对内罗毕的部分高危人群进行追踪研究发现：尽管他们长期和HIV 感染者密切接触（包括无安全措施的性交） ，但这些人有较强的 HIV 特异性 CD8+T 细胞应答，所以未发生 HIV 感染16。在对 CD8+T 细胞应答与母婴传播的关系研究时发现：具有较强的 HIV 特异性 CD8+T 细胞应答的 HIV阳性母亲同 CD8+T 细胞应答弱的 HIV 阳性母亲相比，前者母婴传播的几率明显小于后者，并且被传播的婴儿发展为艾滋病的进程速

62、度明显低于后 者17。 以上研究充分说明 HIV 特异性 CD8+T 细胞在控制 HIV 感染中起关键作用。但对于 CD8+T 细胞应答的作用仍存在争议：如 HLA I 类等位基因同AIDS 的缓慢进展之间的相关性18，对病毒控制功能的丧失同 SIV 模型中病毒对免疫优势 CD8+T 细胞应答逃逸之间的相关性19， 以及病毒血症在 HIV-1感染后的突然升高同直接针对初次病毒感染的 CD8+T 细胞应答衰退之间的相关性20。此外，许多研究表明 CD8+T 细胞在抗 HIV 感染过程中有许多不OPQRSTUVTWXY Z21Z 可解释之处：虽然某些 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞应答很强，

63、但最终仍发展至 AIDS21；绝大多数研究表明 CD8+T 细胞应答同病毒载量无明显相 关22；虽然存在强有力的 CD8+T 细胞应答，但是通过四聚体染色发现有功能的 CD8+T 细胞数量较少。 3.模式识别受体模式识别受体模式识别受体模式识别受体Toll 样受体样受体样受体样受体 病原微生物表面存在一些称为病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)的分子结构，PAMPs 是许多相关微生物所共享但人体所没有的；其结构恒定、进化保守，多为多糖、多核苷酸等，如革兰氏阴性菌表面的 LPS， 革兰氏阳性菌表面的肽聚糖以及来源于病毒的双

64、股 RNA等。PAMPs 有 3 个特征使它们能够很好地被固有免疫系统识别：PAMPs仅由微生物产生，宿主细胞不产生，固有免疫系统能够通过识别 PAMPs 区分“自己”和“非己”成分；在同一类微生物中 PAMPs 不变，使有限的 PRRs能够识别各种微生物感染； PAMPs 对于微生物的生存是必需的， 其结构保守，因而微生物不可能通过 PAMPs 突变逃逸宿主的识别。 固有免疫细胞表面存在可识别 PAMP 的受体，称模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR） 。PRR 基因在基因组中世代遗传，可表达在某一特定细胞类型的所有细胞表面。PRR 分子可与广泛类别

65、病原微生物表面的PAMP 发生特异性结合，启动即时效应。PRR 可分为三类，在血液和淋巴中循环的分泌分子；如可与许多微生物表面甘露糖结合的循环蛋白，该结合可启动补体成分的裂解， 活化补体系统； 吞噬细胞表面可结合病原微生物、使其被吞噬的受体分子；如巨噬细胞表面此类受体可识别某些含有甘露糖的PAMP。当病原体表面多糖中有甘露糖在其顶端时，可被巨噬细胞吞入形成吞噬小体； 固有免疫细胞可与病原体 PAMP 结合， 并启动细胞内信号转导，导致效应分子表达和分泌的受体。 OPQRSTUVTWXY Z22Z Toll 样受体(Toll-like receptor，TLR)就是一类 PRR。1984 年 S

66、teward 等23在果蝇体内发现一种 Toll 蛋白， 该蛋白除了可以促进果蝇背腹极性的形成外，还可以识别入侵的微生物。在果蝇这类无脊椎动物体内是不存在获得性免疫系统的， 但 Toll 蛋白受一些微生物刺激时却会产生对抗微生物的获得性免疫。果蝇在微生物感染时，通过 Toll 蛋白的识别和胞内的信号转导，合成和释放果蝇菌素和杀菌肽等物质，发挥抗真菌和抗细菌的作用，缺失 Toll蛋白的果蝇则易受真菌感染24。 1997 年 Medzhitov 等在人类细胞表面也发现类似 Toll 蛋白的受体(现命名为 TLR4)，后来在其他动物，甚至植物体内发现了类似 Toll 蛋白的受体，于是将其命名为 To

67、ll 样受体25。 TLR 家族属于 IL-1R/TLR 超家族， 主要分布于免疫细胞以及同外界相通的腔道上皮细胞表面，在巨噬细胞、树突状细胞等专职抗原提呈细胞表面的表达尤其丰富， 不同的 TLR 分子识别不同的 PAMP， 其配体几乎涵盖了人类所能遇到的所有病原体及其产物，从而赋予人类先天性抵抗感染的能力。病原体入侵的几分钟内各种 TLR 即可通过相同或不同的信号转导途径诱导一系列基因活化，致使细胞分泌促炎症细胞因子和趋化因子，从而引发系统性炎症反应，发生固有免疫应答，并在适应性免疫应答中起重要的调节作用。 3.1 TLRs 概况概况概况概况 TLRs 家族成员具有相似的结构特征。它们均为型

68、跨膜受体，由胞外区、跨膜区和胞内区 3 个功能区组成。胞外区序列差异大，是与配体结合的特异部位，主要包括十几至二十几个串联的富亮氨酸重复基序(leucinerich repeats，LRRs)，其间有非 LRR 序列分隔，LRR 基序一般由 24 个氨基酸组成，有利于促进蛋白质间的相互黏附，因而认为可用来识别病原体或其产物26。研究显示，存在于不同物种的多种含 LRR 的蛋白都参与宿主对病原体的防御反应。 TLRs 的胞内区由 Toll 同源结构域(Toll homologydomain， THD) 和分子羧基端长短不同的短尾肽组成。THD 至少包括 128 个氨基酸，分为OPQRSTUVTW

69、XY Z23Z 10 个区段，形成螺线相间的二级结构。序列分析发现，TLRs 的 TH 结构域与 IL-1R 胞浆结构域有高度同源性，由此推导它们分子构象也很类似，于是又将 TH 结构区称为 Toll/白介素-1 受体同源结构域（Toll/IL-1 receptor homologous region，TIR)同源区，该区域是向下游进行信号传导的核心元件，这一区域关键位点的突变或序列缺失将阻断信号向下传递。 TLRs 的表达具有特异性。 不同 TLR 和不同物种中同种 TLR 的基因分布都不尽相同。 人的 TLR1-10 基因在染色体上的位置分别为： 4p14、 4q32、 4q35、9q32

70、-33、lq41-42、4p14、Xp22.3、Xp22、3p21.3、4p14；狗和黑猩猩的 TLR9基因分别在 20 号和 3 号染色体上，果蝇和蜜蜂的 18wheeler 基因分别在 2R和 LG2 上。TLRs 细胞分布十分广泛。如 TLR1 广泛表达于单核细胞、T 和B 淋巴细胞、 树突状细胞(dendfitic cell， DC)、 多形核白细胞、 NK 细胞； TLR2主要分布于除 T、B、NK 细胞以外的免疫细胞：TLR3 主要表达于未成熟的DC 等。但 TLR 因其识别的 PAMP 性质不同而在细胞中有不同的分布区。TLR1/2/4/6 分布于细胞表面， 并能聚集到接触微生物

71、的吞噬体上。 TLR3/7/8/9则定位在细胞内， 尤其是内质网上， 并用于识别核酸， 如 TLR3 识别 dsRNA，TLR7 和 TLR8 在一些生物中识别 ssRNA，TLR9 则识别未甲基化的 DNA。不同的 TLR 在各种组织中亦有不同程度的表达，其中在淋巴组织尤其是脾和外周血的白细胞中表达最强。TLR1 广泛分布且表达明显，如卵巢、脾脏乃至帕金氏淋巴瘤组织；TLR2 不如 TLR1 表达广泛，在肺、心脏、脑和肌肉组织可测到 TLR2mRNA 的表达；TLR3 主要表达于胎盘和胰腺；TLR4 表达于胎盘组织、肺等；TLR5 表达于卵巢、前列腺和外周血单核细胞；TLR6和 TLR9 广

72、泛表达于多种细胞；TLR10 主要表达于淋巴样组织和脾脏细胞。TLRs 在生物界高度保守、 分布广泛， 但不同生物的 TLRs 的种类和数量不尽相同。海鞘类、棘皮动物和线虫类也有各自的 Toll 蛋白。在软体类中也发现了 TLR mRNA 的表达，这些都充分说明了 TLR 的出现是极其古远的事件。OPQRSTUVTWXY Z24Z 甚至在植物中也发现 Toll 蛋白的同源体， 它们含核苷酸结合区或 LRR， 其胞内 TIR 区通常在肽链 N 末端而非 C 末端，这与哺乳类 TIR 区的位置恰恰相反。 至今为止， 已有 13 种 TLRs 被克隆出来， 其中表达于人类的有 11 种2728。TL

73、R 在健康成人绝大部分组织中均有表达，但由于种种原因，其表达的差异较大。在转基因小鼠中，TLR4 决定了骨髓源性巨噬细胞的体外炎症反应及脂多糖引起的休克致死性29，通过转基因技术使小鼠 TLR4 过量表达，感染沙门氏菌后，其存活情况明显优于未进行转基因处理的幼鼠30。但人 TLR的高表达又与许多慢性炎症性疾病如动脉硬化症31、牙周炎32、炎症性肠疾病及酒精性肝病33等有关。这些研究提示，TLR 水平可影响各种炎症反应，弄清 TLR 表达调控的分子机制十分必要。虽然病原体诱导 TLR 表达变化的详细机制尚不清楚，但细胞因子及各种生长因子在其中起重要作用是肯定的。通过 IFN- 即可使细胞表面的

74、TLR4 表达增加并增强对脂多糖的免疫应答34。其它一些细胞因子也可影响 TLR 表达，但很大程度上受实验条件的影响。比如 IL-4 下调单核细胞 TLR4 表达，上调 B 细胞 TLR4 的表达35。另一些细胞因子包括 IL-1、IL-2、IL-15、TNF-，巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，巨噬细胞转移抑制因子等也可影响 TLR 的表达。 TLRs 的家族成员在机体对不同病原微生物的免疫反应中均有重要作用。最早认为 TLR2 仅可对 G+菌的胞壁成分 PGN、LTA 进行模式识别，从而激活细胞内信号传导，深入研究表明，其在识别分支杆菌、螺旋体、支原体和酵母菌感染中也发挥

75、重要作用， 可通过识别脂阿拉伯甘露聚糖、 脂蛋白、细菌 DNA 等菌体成分来激活细胞内信号传导，但 TLR2 只有和 TLR6 或TLR1 形成异物二聚体才能对上述物质发生免疫应答。 TLR4 在天然免疫系统对 LPS 的信号传导过程中起重要作用，G-菌释放_abcdecfgh i25i 的 LPS 在血流中与脂多糖结合蛋白(lipoplolysaccharide binding protein,LBP)形成复合物，然后与单核细胞和巨噬细胞表面的 CD14 作用，内皮细胞与成纤维细胞缺乏 CD14，但可利用可溶性 CD14，促进与 LPS 的结合，LPS-LBP和 CD14 三者相互作用激活

76、TLR4 信号途径36。同时发现 TLR4 的激活还需要一种特殊的外分泌蛋白 MD22，该蛋白可与 TLR4 结合形成复合体，是TLR4 与 LPS 信号传导途径中的必要成分。因此，LPS 的识别复合体至少包括 3 种成分，即 CD14、TLR4 和 MD22。虽然已经证实 TLR4 为 LPS 的主要受体，但近年的研究表明，来自于钩端螺旋体的 LPS 通过 TLR2 而非 TLR4传递信号37。 原因可能是此种来源的 LPS 在结构上与典型的 LPS 存在差异，但具体的差异仍有待阐明。 进一步的研究发现， TLR3 能感受 dsRNA 病毒， TLR5 识别鞭毛蛋白和有鞭毛的细菌，TLR6

77、能够与 TLR2 形成复合物来共同识别革兰阴性菌成分、酵母多糖、肽聚糖、支原体脂蛋白等，并且能使 TLR2 的识别作用具有特异性，TLR7 识别双链 RNA，TLR9 识别 CpG DNA38。TLRs 的特异性配体见表 1。 3.2 TLRs 介导的信号转导介导的信号转导介导的信号转导介导的信号转导 因众多信号蛋白的参与，TLRs 的信号转导通路显得极为复杂，不但存在很多争议，更有些机制尚不为人知。目前认为，TLRs 介导的信号途径，包括髓样分化因子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）的依赖性和非依赖性两个途径。 3.2.1MyD88 的依

78、赖途径 MyD88 依赖的信号转导途径以包括 MyD88、IL-1 受体相关激酶（IL-1 receptor-associated kinase， IRAK1） 和IRAK4在内复合物的形成为开始， 以NF-B和促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）的早期活化为特征。TLR5、TLR7和TLR9直接同MyD88 作用，而TLR2 和TLR4 则需要MyD88 样接头蛋白分子（MyD88-adapter-like，Mal）和MyD88 的共同作用。 _abcdecfgh i26i jjjj1kkkkTLRslmnopqrstlmno

79、pqrstlmnopqrstlmnopqrst Table1:Ligand for TLRs and origin uv w v wvxy TLR1 z| TLR2 70 TLR3 RNA PolyI:C TLR4 LPS F 60 70 TLR5 TLR6 | v TLR7 RNA TLR8 RNA TLR9 CpG-DNA TLR10 TLR11 xy _abcdecfgh i27i 静息态细胞中 IRAK-1 因同 Toll 样蛋白相互作用蛋白（Toll-interacting protein，TollIP)结合而保持一定稳定性。经配体刺激后，IRAK-4 发挥激酶的作用使 IRAK-1

80、 磷酸化，从而降低其与 TollIP 的亲和力并转而同 MyD88 结合。 活化后的 IRAK-1 将发生进一步的磷酸化， 高磷酸化的 IRAK-1 与 MyD88解离，进入胞浆募集可溶性肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TNFR-associated factor 6, TRAF-6)，被募集的 TRAF-6 与 T6BP(TRAF-6 binding protein)结合，进行一系列低聚化和泛素化反应。 支架蛋白 TAB-1 和 TAB-2 介导 TRAF-6 对 TAK-1 的活化作用。TAK-1的活化可形成包括 IKK、IKK 和 IKK(也叫 NEMO，NF-B essential mo

81、dulator)的高分子量复合体信号小体，磷酸化一系列被称为 IB 的NF-B 抑制物，IB 磷酸化后发生泛素化并降解，从而解除了对与之结合的NF-B 的抑制作用，游离的 NF-B 转位入核，与 DNA 结合发挥转录调控作用39,40。 TRAF-6 还可通过 ECSIT( evolutionarily conserved intermediate in the Toll pathway ， 进化中保守的 Toll 途径中介者) 同 MEKK1 作用促进 MEKK1活化，并激活 ERK1/2、JNK 和 MAPKp38 三条级联反应。支架蛋白 JIP3 可同某些 TLR 的胞内段、 MEKK1

82、、 MKK4/7 和 JNK1/2 结合， 易化几者间作用，促进 JNK 的活化。JNK 激活转录因子 ATF-2 和 c-Jun，促进 iNOS 和 COS-2的转录和细胞因子分泌41。 3.2.2 MyD88 非依赖途径 TLR3 和 TLR4 可由 干扰素 TIR 结构域衔接蛋白（Toll/IL1 receptor domaincontaining adaptor inducing IFNbeta，TRIF）进行 MyD88 非依赖途径的信号转导，诱导 IFN- 和 IFN 诱导基因的表达并伴随 NF-B 晚期活化，其中 TLR4 通过 TRIF 相关接头分子 （TRIF-related

83、 adaptor molecule， TRAM）同 TRIF 相连，而 TLR3 则直接通过 TRIF 进行信号转导。 TRIF 也能够通过与 MyD88 相似的作用引起 NF-B 的晚期低水平活化， 28 但其主要的生理学活性有赖于转录因子干扰素调节因子-3 （interferon regulate factor-3，IRF-3） 。免疫沉淀反应显示 TRIF 可同 IRF-3 作用，IRF-3 活化后形成同源二聚体转位入核，诱导 干扰素（interferon-，IFN-）基因表达。IKK-I/IKK- 和 TBK-1/T2K 可通过 TRIF 氨基端的非 TIR 区域与之相结合，二者的过表

84、达都可以导致 IFN- 和 RANTES 启动子的活化，且这种活化可因任何一个分子的功能缺失而被阻断，从而推断二者可能为 TRIF 下游信号分子，介导 IRF-3 的活化，但其生物学活性和作用机制仍需进一步的试验证实42,43。 IFN- 表达后通过 IFNAR-1/IFNAR-2 异二聚体受体复合物引起 Tyk2 和Jak1 的交叉活化，Tyk2 和 Jak1 使 STAT1 和 STAT2 酪氨酸残基磷酸化，并进一步形成同源二聚体(STAT1STAT1)、 异源二聚体(STAT1STAT2)或异源三聚体(STAT1STAT2干扰素调节蛋白 9)，这些多聚体复合物转位入核结合于特定的 DNA

85、 位点最终导致 IFN 诱导基因的表达。 STAT-1 的完全活化还需要其丝氨酸残基的磷酸化，这一反应在 TLR2 和 TLR4 信号转导通路中分别为MyD88 依赖和 TRIF 依赖44。 4TLRs Fig.4: TLRs signal transduction pathway 29 3.3 TLRs 介导的功能介导的功能介导的功能介导的功能 3.3.1 促进细胞因子的合成与释放，引发炎症反应 这是 TLR 最突出的生物学功能。单核巨噬细胞、树突状细胞等通过膜表面表达的 TLR 感受入侵病原体的 PAMP 刺激后， 经由胞内信号传导通路，最终由进人胞核内的活化 NF-B 启动核内相关基因，

86、转导出相应的 mRNA，从而合成 IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF- 及 IFN- 等细胞因子并释放到胞外，引起粒细胞、巨噬细胞趋化聚集，毛细血管通透性增高，淋巴细胞浸润等炎症反应，发挥早期免疫应答的效应。Arbour45等发现 83 名健康志愿者吸人 LPS 后，52 人(63)出现高反应，而 31 人(37)低反应或不反应。进一步研究发现这些低反应或不反应的人由于呼吸道上皮和肺泡巨噬细胞上的TLR4 受体基因发生了错义突变，从而导致 TLR 受体胞外区对吸入的 LPS反应迟钝，这从另一方面说明了 TLR4 在转导 LPS 信号中的重要作用。不同的 TLR 接受同一种 PAM

87、P 刺激， 所诱发产生的细胞因子的种类是不一样的，提示当同一种病原体人侵时， 其往往能活化体内多种 TLR， 从而使得由 TLR诱发的天然免疫应答是具有多样性的，促使免疫系统对病原体的杀伤和清除是有效的。 3.3.2 促进免疫细胞膜表面表达相关免疫分子，促进免疫细胞的成熟和功能化 LPS 可经 TLR2 促进静止树突状细胞表达 CD83、 MHC II、 CD80、 CD86、CD54 和 CD58 等膜分子，从而使 DC 拥有这些处理和提呈抗原所必须的表面结构分子，成熟的 DC 得以产生46。另外，Visintin 等47的研究表明，尽管TLR1和TLR4在人DC细胞的表达水平较低， LPS

88、促使其成熟的前后TLR表达在单个细胞的密度只有几百到几千这样 10 倍左右的变化，表明 TLR 活化 DC 的效率是非常高的，已有的证据支持 TLR4 通过 LPS 诱导途径活化DC，但 TLR1 在其中的作用仍有待研究。Visintin 等的实验表明在 TLR1-5中只有TLR3在iDC表达增高， 提示其对DC有特殊的作用。 由于DC对PAMP 30 的天然识别是获得性免疫发生的关键一步，因而其对 DC 的成熟有很重要的调节作用。 3.3.3 抗病毒感染 Kurt-Jones 等48发现呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus ,RSV)的一些融合蛋白能诱生促炎

89、症细胞因子，与正常对照小鼠比较，RSV 在 TLR4缺陷小鼠中的复制量更多且持续时间更长，提示 TLR4 能促进机体对病毒的清除。另外 RSV 的融合蛋白(F)能诱导表达 CD14 和 TLR5 的单核细胞产生IL-6； 因此， 靶向TLR或CD14信号途径可能是治疗病毒感染的新途径。 Bowie等49研究表明痘苗病毒通过模仿 MyD88 依赖的 IL-1、 TLR4 和 IL-18 信号传导通路中的起负反馈作用的短链 MyD88， 阻滞了 NF-B 活化后的免疫效应，从而躲避免疫系统对其的清除作用， 但非 MyD88 依赖的信号通路不受影响，提示病毒可通过影响启动天然免疫相关的 TLR 等信

90、号传导途径而降低对病毒的反应，甚至处于无反应的状态。 3.3.4 调节免疫应答 在一定的条件下，LBP 可激活 TLR2 信号途径，产生促凋亡蛋白(Fas-associated death domain protein，FADD)和 Caspase-8，导致表达 TLR2 的细胞发生凋亡，从而可降低过度的免疫应答，调控机体对入侵病原体的免疫应答在适度的水平50。最近的研究表明抗原识别受体和 MyD88 依赖的 TLR家族协同作用可介导自身反应性B细胞产生IgG的自身抗体从而参与获得性免疫应答的调节51。 3.3.5 诱导一氧化氮(nitrogen monoxide，NO)依赖性杀菌活性 Tho

91、ma-Uszynski 等52的研究结果表明结核分枝杆菌的脂蛋白可通过刺激小鼠的 TLR2，从而诱发 NO 依赖性的杀菌活性，但所诱导的人单核细胞的杀菌活性则不依赖于 NO。Means 等53用结核分枝杆菌活菌刺激小鼠和人巨噬细胞得出不同结论，即 NO 的产生与 TLR2 和 TLR4 无关。 31 3.3.6 TLR 间的协同作用 现已发现有些 TLR 对 PAMP 的识别有协同或拮抗的作用。如 TLR6 可增强 TLR2 对 G+菌肽聚糖和表皮金葡菌来源的酚溶性调剂蛋白的反应， 但不影响其对脂肽的识别54。另外，Bulut 等55研究提示 TLR2 和 TLR6 协同作用可能参与对所有 T

92、LR2 配体的识别， 而且实验还证实融合的 TLR2 和 TLR6可以抑制 TLR2 和 TLR4 配体的激活过程。此外，TLR2、TLR4 与 TLR9 对PAMP 的识别也存在着协同作用56。 3.3.7 TLR 与败血症的全身免疫病理学损伤有关 败血症时细胞因子明显增多，众多免疫细胞内 STAT 活化明显，并与细胞凋亡、急性肺损伤、感染性休克等全身免疫病理学损伤相关。在败血症动物模型中，细菌内毒素(LPS)、肠毒素 B(SEB)是常见的致病因子，体内、体外实验证实这两类毒素刺激均能引起细胞内多条信号转导途径的活化，其中尤以 LPS 通过在细胞膜上的受体 CD14、Toll 样受体、CD1

93、1/CD18 等启动天然免疫应答关系密切。Beutler 等57认为败血症与 TLR 识别 PAMP 后介导的过激天然免疫应答的发生密切相关，TLR 在这起到了“换能器”的作用。而感染性休克的分子作用机制：细菌脂多糖通过 TLR 激活失控的 NF-B 的生物学效应58，也与 TLR 息息相关，人们也试图制备 TLR 单克隆抗体用以特异性阻断由 TLR 介导的 NF-B 活化效应，从而为研制控制全身免疫病理学损伤所导致的感染性休克的新药品打下基础。 4.TLRs 与免疫调节与免疫调节与免疫调节与免疫调节 4.1 TLRs 在免疫系统的表达在免疫系统的表达在免疫系统的表达在免疫系统的表达 TLRs

94、 在免疫系统广泛存在，不仅表达于各种免疫细胞，还大量表达于各种上皮和内皮细胞等天然免疫的第一道防线，如肠上皮、呼吸道、泌尿道生殖上皮及血管内皮等。虽然 TLRs 在免疫系统广泛分布，但是不同细胞的 32 TLRs 表达水平并不相同。单核细胞/巨噬细胞以及中性粒细胞是表达 TLRs 种类最多的细胞59,60； B 淋巴细胞也较为丰富60； 嗜酸性粒细胞表达TLR1、TLR4、TLR7、TLR9 和 TLR1061；而 T 细胞表达 TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR962-65。TLRs 在树突状细胞(DC) 的分布较为复杂， 并在某种程度反映了 DC 亚群相应的

95、功能。 人浆细胞样的 DC(pDC) 是近年来较受关注的一类特殊的细胞群，表达 TLR7 和 TLR9，双链 DNA 和单链 RNA 病毒能诱导此类细胞分泌大量的型干扰素6667。pDC 不表达TLR2、TLR4、TLR5，所以对细菌产物如 LPS、肽聚糖、鞭毛没有反应，而CD11c+的人髓系 DC 或者单核细胞却可以识别这些来自菌体 TLR 的配体。 另外 CD11c+表达 TLR3，可能在抗双链 RNA 病毒发挥重要作用。 4.2 TLRs 调节感染部位免疫细胞的募集调节感染部位免疫细胞的募集调节感染部位免疫细胞的募集调节感染部位免疫细胞的募集 免疫系统一个显著的特征是免疫细胞的迁移，通过

96、迁移有效地监视、攻击和清除入侵的病原体。免疫细胞的迁移有两种类型: 一是稳态下的细胞迁移，另一种是通过诱导发生的迁移。诱导迁移通常由 PRR 活化而激发，使免疫细胞到达感染部位。 当病原体入侵时， 机体的天然免疫系统可通过 TLRs识别病原体保守的 TLRs 配体促进细胞的迁移。首先，感染时内皮细胞受TLRs 刺激， 上调选择素的表达， 促进白细胞出脉管过程68。 其次， 通过 TLRs识别 PAMP 诱导大量的趋化因子的分泌，以及上调趋化因子受体基因的表达。炎症反应中关键的趋化因子包括 IL-8(CXCL8)、GRO-(growth-related oncogene-，CXCL1)、MCP-

97、1(monocyte chemoattractant protein 1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP-1(macrophage inflammatory protein-1)、MIP- 以及RANTES。这些趋化因子结合在脉管内表面激活白细胞，并诱导白细胞表面整合素构象的改变， 使白细胞牢固结合于内皮表面69。 整合素配体(如 ICAM分子)的表达也受 TLRs 的调节，这种调节可以是直接的，或者 TLRs 先激活巨噬细胞，其分泌的 TNF 和 IL-1 间接上调内皮细胞的整合素配体。脉管内 33 皮细胞 TLRs 的表达可直接调节细胞的迁移，在 TLR4 缺陷的嵌合小鼠(白

98、细胞的 TLR4 功能缺陷或是内皮细胞 TLR4 功能缺陷)中，注射 LPS 诱导中性粒细胞快速肺浸润需要内皮细胞 TLR4 表达， 而不是中性粒细胞的 TLR470。所以，TLRs 在调节免疫细胞募集中扮演重要的角色。 4.3 TLRs 激活天然免疫细胞激活天然免疫细胞激活天然免疫细胞激活天然免疫细胞 天然免疫的细胞，如单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞，自然杀伤细胞（natural killer cell ，NK）等， 都不同程度地表达 TLRs。病原体入侵时，TLRs 被相应的 PAMP 所激活，除了通过刺激天然免疫细胞分泌大量的细胞因子、趋化因子诱导炎症反应外，还可直接增

99、强天然免疫系统对病原微生物的清除能力。一方面，TLRs 增强吞噬细胞的吞噬能力，如TLRs 激活后中性粒细胞、巨噬细胞的吞噬能力明显增强71,72，相反的抑制TLRs 的信号通路，吞噬功能降低73。实验表明，TLRs 能上调 MACRO、SR-A、CD36、LOX-1 等与吞噬相关的基因表达72。另一方面，TLRs 的激活增强天然免疫细胞的杀伤能力， 如 TLR2 诱导小鼠巨噬细胞产生一氧化氮杀死胞内的结核杆菌74，TLRs 还可以激活维生素 D 介导的杀菌反应75. 4.4 TLR 激活上皮细胞激活上皮细胞激活上皮细胞激活上皮细胞 上皮层如肠道、 呼吸道、 泌尿道上皮是天然免疫防线的第一道屏

100、障， 也表达许多类型的 TLRs76,77。 通过 TLRs 识别病原体， 诱导上皮细胞产生细胞因子、趋化因子以及抗微生物多肽。上皮细胞分泌的趋化因子能够扩散至周围局部组织以及淋巴组织脉管内皮表面，参与细胞的募集。抗微生物多肽是进化过程中保守的天然免疫分子，从昆虫到人甚至是植物都有这类多肽的存在。抗微生物多肽能够直接杀死细菌或者真菌，在宿主的天然免疫中起重要作用，在果蝇中存在抗真菌肽 Drosomycin 或抗革兰氏阴性菌肽 Diptericin， 两者分别受 Toll 和 IMD 途径调控，若 Sptzle/IMD 突变，果蝇将易于被微生物感染78。在哺乳动物中也发现了许多抗微生物多肽，如

101、-defensin、 34 -defensin 等，这些多肽表达于肠道上皮、呼吸道、泌尿生殖道上皮细胞79。有研究表明，LPS 或者细菌能够刺激胃肠道 lieberkhn 隐窝深部的潘氏细胞表达 -defensin80，而细菌的脂蛋白通过激活 TLR2 能诱导肺上皮细胞系A549 分泌 -defensin81。所以，通过 TLRs 能够诱导上皮细胞分泌抗微生物多肽，直接参与清除病原体。 4.5 TLRs 在天然免疫中的识别作用在天然免疫中的识别作用在天然免疫中的识别作用在天然免疫中的识别作用 天然免疫发挥防御作用的关键是对病原体的识别，这一识别主要是由TLRs 来完成的。其中 TLR4 不但识

102、别外源的病原体，还可识别内源性物质及其降解产物。通过对基因缺陷小鼠的研究发现 TLR4 参与 LPS 的识别。而且这一识别还需要 LPS 结合蛋白(LBP)，MD2 的辅助。TLR4 还可识别宿主坏死细胞释放的热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)， 体内类肝素硫酸盐和透明质酸盐降解的多糖部分以及局部的内源性酶的级联活化反应也激活 Toll样受体。人们还发现 TLR4 可能还参与了病毒的识别如呼吸道病毒 RSV。TLR2 的配体较 TLR4 广泛， 包括脂蛋白、 脂多肽、 脂壁酸、 阿糖甘聚糖(LAM)、酵母多糖及细菌的 CpG-DNA。 而且 TLR2 还可和其它 TLR

103、s 形成异二聚体识别 TLR2 的配体，这就使得 TLR2 的识别更广泛。 4.6 TLRs 对对对对获得性获得性获得性获得性免疫的调控免疫的调控免疫的调控免疫的调控 4.6.1 TLRs 在启动获得性免疫中的作用 获得性免疫的启动需要双信号，初始 T 细胞的活化不仅需要特异性抗原的刺激，还需要共刺激信号的辅助。这些信号大多是由 APC(如 DC)所提供的。存在于外周的未成熟的 DC 有很强的内吞能力，这有利于抗原的摄取。DC 被多种微生物成分活化，然后成熟并表达多种 TLRs，如:TLR1、2、4、5。而且，微生物成分引起的 DC 的成熟是通过 TLRs引发的，这些成分包括:LPS、CpG-

104、DNA、肽聚糖、脂蛋白以及分支杆菌的细胞壁成分。 35 4.6.2 TLRs 对获得性免疫应答类型的调控 不同病原微生物感染所引起的细胞或体液免疫实际上主要是由 Th1 和Th2 通过分泌不同的细胞因子所诱导的。 调节 Th1 和 Th2 增殖和分化的因素主要包括细胞因子、激素、抗原和抗原提呈细胞以及共刺激分子。目前认为IFN-、 IL-12 是促进 Th1 分化的主要细胞因子。 IL-4 主要启动 Th2 方向分化。APC 细胞类型在前体 Th 细胞(PTh 细胞)的分化中也是主要因素。对这些影响因素的研究焦点最后集中于存在于 APC 上的模式识别受体上，TLRs 在这一影响过程中起了重要的

105、作用。 已有的研究认为不同亚型的 DC 诱导不同的 Th1 和 Th2 应答。如髓样DC 诱导 Th1 分化，浆细胞样 DC 诱导 Th2 分化。不同亚型 DC 的 TLRs 表达谱不同。 IPCs(天然干扰素/产生细胞， 浆细胞样DC 前体细胞)表达TLR7 和 TLR9，TLR1、TLR6 和 TLR10 仅有微量表达。血中 CD11c+mDC 和单核细胞有着相同的表达谱。虽然表达水平不同，但二者都表达 TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR8，特别是 mDC 还选择性地表达 TLR3。和 TLRs的表达一致，不同的 DC 亚型识别不同的 TLRs 配体，产生不同的细胞因

106、子。IPCs 通过识别 CPG-DNA 快速产生 IFN/，并发育为成熟 DC82-84。但因无IL-12 的产生而不能诱导 Th1 分化。相反，血 mDC 和单核细胞通过 TLR2或 TLR4 识别 PGN 或 LPS，产生不同的细胞因子如 TNF-、IL-6、IL-2、IL-1285-87。而且，poly(I:C)可经 TLR3 途径刺激 mDC 产生 TFN/ 和 IL-12并使其成熟，产生的 IL-12 可使 Th 向 Th1 方向分化。但是 DC 亚型的功能相当复杂，并且它们引起某一类型 Th 应答的能力可能还依赖于微生物的微环境。 如同样表达 TLR7 的 IPCs 和 mDC 受

107、其配体刺激后产生的细胞因子却不同，IPCs 产生 IFN-，mDC 产生 IL-12，因此浆细胞样 DC 没有诱导 Th1分化，而髓样 DC 却诱导了 Th1 分化。这或许提示 TLRs 的表达和 DC 本身都是影响 DC 应答的因素。通过对 MyD88 缺陷鼠的研究发现，MyD88 缺陷 36 鼠在受到含完全弗氏佐剂的抗原(CFA)刺激后表现出 Th2 应答倾向，但这并不是由于缺少 IL-12 的产生所致，因为 IL-12 缺陷鼠模型并未表现出 Th2 应答88。而且，通过 TLR4 信号转导可以使野生鼠和 MyD88 缺陷鼠的 DC 分别向支持 Th1 和 Th2 应答的 DC 类型分化8

108、9。虽然这些证据表明，TLR4 的MyD88 非依赖性途径下游的信号活化可能引起 DC 向诱导 Th2 应答方向分化。但是目前尚无证据表明 Th2 应答是 TLR2 非依赖性的。而且，寄生虫诱导的 Th2 应答是否有 TLR 的参与也尚未得到证实。 4.6.3 TLRs 的抗微生物活性 除了可以调控获得性免疫，TLRs 的活化还直接诱导了吞噬细胞的抗微生物活性。TLR2 的活化分别引起鼠和人巨噬细胞胞内分支杆菌的 NO-依赖性和非依赖性死亡。 由微生物入侵引起的果蝇 Toll 和 IMD 通路的活化导致了抗微生物肽段的合成，而且单一抗微生物肽段的表达就足以恢复 Sptzle/IMD 双突变果蝇

109、对微生物感染的敏感性。由此可见抗微生物肽段在果蝇机体防御中的重要作用。在哺乳动物中，抗微生物肽段 2 防御素通常是由胃肠道上皮、气道上皮及皮肤的几种上皮细胞分泌的。 胃肠道隐窝的潘氏细胞在受到 LPS 或细菌刺激后分泌 2 防御素。由此可见，哺乳动物抗微生物肽段是在受到微生物刺激后在上皮表面产生的。 同时， TLR4 在小肠隐窝有高表达90， 而且 LPS 诱导了鼠 2 防御素 2、3 和 6 的表达，用脂蛋白刺激人肺上皮系 A549 还可引起 TLR2 介导的 -防御素的产生。这些均表明 TLRs 可能介导了抗微生物肽段的分泌。因此调节了细菌在上皮表面的直接死亡。入侵的细菌感染巨噬细胞后使其

110、凋亡，机体通过细菌在入侵部位的局部死亡而限制了细菌的扩散。脂蛋白诱导的巨噬细胞的凋亡中有 TLR2 的参与91，LPS 诱导的内皮细胞的凋亡有 MyD88、IAAK21 和 FADD 的参与92。因此推测出 TLRs 可能参与了由感染或细菌成分引起的凋亡。 37 4.6.4 TLRs 对 T 细胞和 B 细胞的激活 获得性免疫始于 DC 细胞捕获病原微生物抗原，捕获抗原的 DC 迁移至次级淋巴组织将抗原呈递给初始 T 细胞，介导 T 细胞的激活。不成熟的 DC受 TLRs 配体刺激导致炎症趋化因子受体如 CCR6 的下调93,94，而归巢受体如 CCR7 上调95,96，有利于 DC 的迁移。

111、不成熟 DC 在迁移过程中逐步转变为成熟，获得刺激 T 细胞能力，在淋巴结的 T 细胞区，诱导抗原特异的 T细胞激活并分化为相应的效应细胞。 DC 细胞激活 T 细胞需要两种信号:第一种是抗原肽-MHC 分子复合物提供的抗原特异信号；第二种是共刺激分子，如 B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40 提供的共刺激信号。第一种信号的提供跟 TLRs 密切相关，近期Nature的文章报道 DC 吞噬抗原后是否能够有效地将抗原肽递呈给 T 细胞和 B 细胞，取决于抗原中是否存在 TLR 有效配体，DC 有选择地递呈病原微生物抗原，而不呈递不含 TLRs 配体的凋亡细胞抗原97。 在抗感染免

112、疫中， 第二种信号主要由TLRs提供， TLRs识别PAMPs使 DC 表达共刺激分子。 DC 活化 T 细胞还需要抑制周围调节型 T 细胞(Treg)的活性， TLRs 能够刺激 DC 细胞分泌 IL-6 等细胞因子作用于调节型 T 细胞， 从而抑制它们的活性98,99。在获得性免疫中 B 细胞的激活同样需要 TLRs 的刺激。研究表明，单纯的 CD4+T 细胞激活还不足以诱导 B 细胞产生抗原特异的 T 细胞依赖型抗体，需要 TLRs 对 B 细胞的激活100。 虽然 DCs 是 TLRs 介导的固有免疫识别至 T 细胞和 B 细胞激活的关键，但现在有越来越多的证据表明，除了与 DCs 相

113、关的间接效应机制，TLRs 还可直接调节获得性免疫细胞功能，从而直接调节获得性免疫应答。Peng G 等101研究了 TLR8 信号转导与调节性 T（regulatory T，Treg）细胞功能调节的机制， 发现 TLR8 及其固有配体能够逆转 Treg 细胞功能， 这种效应不依赖于DCs，但需要 Treg 细胞中功能性的 TLR8-MyD88-IRAK4 信号转导。Crellin NK102发现人 CD4+CD25+Treg 和 CD4+CD25-T 细胞都表达 TLR5，其表达水 38 平与单核细胞、DCs 水平相当。除了 APCs 介导的间接效应，TLRs 配体还可以直接作用于调节性 T

114、 细胞， 并调控 Treg 细胞的抑制性活性。 Caron G103观察 TLRs 配体是否可以调控高度纯化的人 CD4+T 细胞功能，发现在没有APCs 的情况下，鞭毛蛋白（TLR5 的配体）和 R-848(TLR7/8 的配体)协同TCR依赖性或非依赖性刺激， 可以上调CD+T细胞增殖和IFN-、 IL-8和IL-10产生，首次展示了 TLR5 和 TLR7/8 配体对人类 T 细胞的直接效应。 4.6.5 TLRs 诱导型干扰素（IFN）表达 型干扰素包括 IFN-、IFN-、IFN- 和 IFN-，是连接天然免疫和获得性免疫关键的枢纽分子，除了在抗病毒方面起着重要的作用外，还在促进获得

115、性免疫方面发挥重要的功能。TLRs 可诱导 DC 产生型干扰素，进而促进 DC 的成熟及分泌 TH1 型的细胞因子104,105。不同的 TLRs 诱导产生型干扰素能力并不相同，TLR3/4/7/9 能诱导产生 IFN/，而 TLR1/2/5/6 却不能。 型干扰素的产生跟 DC 亚群有密切的关系， pDC 是型干扰素分泌细胞(type 1 interferon-producing cells，IPC)，高表达 TLR7 和 TLR9， 受到相应配体刺激时诱导大量的 IFN-106， 而 mDC 虽然也表达 TLR7 和 TLR9，但是受体被激活后产生的细胞因子是 IL-12。在生理情况下，一

116、种病原体往往带有多种 TLRs 配体的组合， 理论上 TLRs 应该能够识别其中一种配体， 诱导型干扰素(IFN)的产生来调节天然免疫或获得性免疫。 4.6.6 TLRs 调节 TH1/TH2 免疫反应 TLRs 和 Th1 应答：激活的 TLR 通过促进细胞表面抗原提呈，诱导CD80/CD86 的表达，使抗原提呈细胞(APC)趋于成熟。CD80 和 CD86 是 B7家族的成员，参与 T 细胞上 CD8 特异性相互作用，在这一过程中它们提供了对抗原初始 T 细胞，特别是对 CD4+T 细胞系激活和分化起关键作用的共刺激信号，这一共刺激过程也间接促进 APC 的活化和成熟，并使 CD40 配体

117、(CD154:表达在激活的 CD4+T 细胞上)与 APC 上 CD40 结合， 导致 APC 来 39 源的细胞因子产生和 B7 的表达。这些 APC 主要是树突状细胞，它们获得了激活抗原初始 T 细胞的能力，并使它们向 Th1 或 Th2 细胞分化。Th1 型适应性免疫应答由 IL-12、IL-23 和 IL-27 诱导，以产生 IFN- 和 IgG2a 同型抗体为特征， 相反 Th2 型适应性免疫应答由 IL-4 和一些不明因素诱导， 它与 IL-4、IL-5、 IL-13 的产生和 IgE 同型抗体以及 IgG 的 IgG1 亚群有关。 TLR 配体通常诱导 APC 产生 IL-12，

118、 这被认为是它们促进 Th1 型适应性免疫应答的主要机理。MyD88 是细胞内所有 TLRs 下游信号的衔接子，这个衔接子缺陷的小鼠被认为是 TLR 信号缺陷小鼠。 然而破坏 MyD88 基因也影响 IL-1 家族成员诱导的信号。 另外在这一信号传导途径上还存在其它分子(如: TIRAP)作为某些 TLRs(例如诱导针对 TLR4 激活反应的 B7 共刺激分子的表达)非依赖MyD88 的信号传导途径的衔接子。 MyD88 缺陷小鼠除了存在削弱 APC 对某些 TLR 增效剂的反应，还不具备针对完全福氏佐剂(含有加热灭活的结核分枝杆菌， 这些成分能激活TLRs, 例如TLR2和TLR4)抗原的T

119、h1型免疫应答，相反 Th2 型免疫应答(明矾作为佐剂诱导 Th2 型免疫应答为主)被完全保存下来。 这些发现被 Jankovic 等证实， 他对微生物感染的前后关系进行了深入研究。 通过研究 MyD88 缺陷小鼠证实， 产生 IFN- 的 CD4+T 细胞对接种 gondii 弓浆虫起源的可溶速殖子提取液无应答。这些研究发现具有重要意义，因为Th1 型 CD4+T 细胞由于 IL-12 的缺乏(用 IL-12 缺陷小鼠)不能产生针对微生物抗原的免疫应答，尽管另外的细胞因子如 IL-23 和 IL-27 也可以扮演相似的角色107，但普遍认为 IL-12 是启动 Th1 型免疫应答的主要因子，

120、相反MyD88 的缺陷导致CD4+T细胞对Th2 型反应无应答， 这些结果说明MyD88信号参与了抗原初始 CD4+T 细胞分化为 Th1 或 Th2 细胞系的过程108。 因此微生物与 TLRs 相互作用构成了一个早期 CD4+T 细胞分化的关键稽查点(checkpoint)，并且指出 TLRs 在决定适应性免疫应答的性质上具有极重要的 40 作用。 近来研究显示 TIRAP(也称 MAL)是对另一个对 TLR2 和 TLR4 应答具有重要作用的衔接子，通过对 TIRAP 缺陷和 TIRAP/MyD88 缺陷小鼠的研究，提出存在 TLRs 诱导信号的缺陷，然而仍有报道称在这些小鼠中有适应性免

121、疫应答的发生。 TLR信号途径参与Th1型应答在受体相互作用蛋白2(receptor interacting protein， Rip2)缺陷小鼠中得到证实； Rip2(也 RICK、 CARDIAK、 CCK 和 Ripk2)是一个丝氨酸/苏氨酸激酶参与了 TNF- 诱导的 NF-B 的激活。Rip2 被证明与 TLR2 对肽聚糖刺激瞬间反应有关， 并且对 TLR 诱导的细胞因子的产生起重要作用。 体外分析与野生型小鼠相比， 免疫Rip2缺陷小鼠产生较少的IgG-a和 IFN-。另外 Rip2 缺陷的 CD4+T 细胞对 T 细胞受体结合反应减弱，并且在体外分化成 Th1 细胞时产生很少量的

122、 IFN-，这些结果证明与 MyD88 相似的 Rip2 对 Th1 型免疫应答的发展是必需的。 然而在体内仍有不清楚之处，Rip2 是否是最佳 Th1 型免疫应答的细胞(如 APC)TLR 信号的组成部分， 是否是 T 细胞受体信号途径的组成部分。TLRs 也可能具有潜在直接调节 T 细胞的免疫能力。人类 CD4+T 细胞表达多种 TLRs，其中 TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR9 和 TLR10 占优势，这可能也适用于小鼠。尽管 TLR 在 CD4+细胞的表达比单核细胞普遍低，但 TLR3 和 TLR9 在这两种细胞的表达是相似的，而且 MyD88 在 CD4+和 CD8+T

123、 细胞、B 细胞、单核细胞上以同样水平高表达109。 所以除了 TLR 信号途径对 APC 的特有影响外， 它们在 CD4+T 细胞的激活和分化上可能也起直接作用。对 CpG-寡脱氧核糖核酸和人类 T细胞的研究有力的证明了这一点。早就知道细菌 DNA 和含有未甲基化 CpG基序的 DNA 可以作为佐剂刺激 Th1 应答，并且诱导和激化疾病模型 Th1 依赖(例如鼠科动物试验性自身免疫性脑脊髓炎和大肠炎)110,111的病理反应， 这些效应已被广泛证实是由 TLR9 介导的。 CpGDNA 被发现直接作为共刺激分子使 T 细胞激活，在缺乏 APC 时在对抗原刺激的应答中 IFN- 的产生增加。

124、41 尽管在这些研究中 TLR9 的作用还没有被证实，但很有可能正是 TLR9 介导了 CpGDNA 的增强 Th1 效应。 TLR 除了作为信号途径分子外， TLRs 本身也具有调节适应性 Th1 型免疫应答的能力，许多研究报告验证了这一点。细菌脂蛋白是 TLR2(与 TLR1结合)的激活剂，它们合成的衍生物被越来越多地用作疫苗佐剂。为了阐明其中的机理，用合成的脂蛋白刺激人外周血单核细胞，结果 T 细胞增殖并产生 IFN-(不是 IL-4)112。 抗体中和实验证实这些刺激效应是由 TLR2 介导的，而不是 TLR4， 并且仅需要 T 细胞和单核细胞参与。 一个有意义的观察发现，诱导 T 细

125、胞的增殖是非依赖外源性蛋白的。有报道称脂蛋白经 TLRs 可以诱导单核细胞向树突状细胞和树突细胞样的细胞成熟， 从而降低了 T 细胞对提呈内源性蛋白的初始应答。因此应用 TLR 配体作为疫苗的佐剂具有重要意义，因为在某些情况下对自身蛋白的反应能变成接种疫苗有害的副反应，并且导致自身免疫紊乱的发生，然而应用被脂肽激活的 TLR2 的潜在意义近来也被证实，Duesberg 等113发现被脂肽激活的 TLR2 与含有 pam3cys 脂质短肽的丙肝病毒蛋白具有相似的增强免疫源性的作用，这些脂肽大大增强了体外慢性丙肝病人丙肝病毒特异性 T 细胞的应答，而在这些短肽单独存在时只有微弱的应答。TLR7 也

126、好像具有直接调节 Th1 型适应性免疫应答的能力。 浆细胞样树突状细胞和髓细胞样树突状细胞都可以被合成的 TLR7 配体imiquimod 和 R848 激活， 发生从不成熟表型到成熟表型的转换， 而且激活的细胞都诱导 CD4+T 细胞分化为产生 IFN2 的 Th1 细胞。髓细胞样树突状细胞和浆细胞样树突状细胞的 Th1 细胞分化是分别依赖于 IL-12 和 IFN-。尽管 imiquimod 的抗病毒机制还不十分清楚，但 imiquimod 是个有效的抗病毒化合物，它被临床上公认是治疗与乳头瘤病毒相关的生殖器疣状物的药物。这些发现进一步支持了 TLR 的作用和它们在治疗感染性疾病中诱导 T

127、h1 的能力。 42 TLR4 是一个复杂的受体， 它的激活需要其它细胞表面分子(例如 MD22、CD14)，并且多种分子好像都可激活它114。这些分子不仅包括某些细菌成分如 LPS，而且还有上述多种内源性因子。Beg115近来提供了内源性 TLR 配体调节适应性免疫应答的证据，并且总结出这些配体在诱导炎症反应中的作用，它们具有促进组织修复的能力，而不具有增强免疫的能力。然而研究表明 2 防御素 2 是一个新的 TLR4 配体，它是在细菌感染的粘膜表面产生的一种抗微生物多肽。 2 防御素 2 刺激树突状细胞的成熟， 并使 CD86 和 CD40的表达水平增高，并且产生 IL-12 和 IL-1

128、。实验证明 2 防御素 2 的效应不是由于含有 LPS(严格研究其生物学效应它是被 TLR4 介导的非依赖 LPS 的)、 2防御素2和LPS在树突状细胞诱导相似的基因表达轮廓， 而在于TLR4 信号缺陷的小鼠没有这些效应、说明 TLR4 参与了 2 防御素 2 的反应。最后用 2 防御素 2 治疗的小鼠产生了有效的依赖于 IFN- 的抗肿瘤免疫应答，并有效根除了肿瘤，这证明除了 LPS 诱导 Th1 的活性，TLR4 也参与了 Th1对内源性分子免疫力的产生。 目前仍需确定是否2防御素2介导的TLR4 激活途径参与了体内微生物感染的适应性免疫应答的调节。 TLRs 与 Th2 应答：Th1

129、型应答几乎没有证据说明 TLRs 能调节 Th2 型免疫应答。事实上许多数据证明，具有 TLRs 诱导 Th1 的能力能预防有害的Th2 型免疫应答为特征的变态反应性疾病的发生和发展，这是 Th1 和 Th2型免疫应答相互以消极的方式调节彼此的活性。 CpG-寡脱氧核糖核酸和 LPS都能抑制哮喘性肺炎诱导的变态反应，给鼠哮喘模型敏感变应原刺激后，来源于肺淋巴结的淋巴细胞产生血清 IgE 和 Th2 细胞因子。 这些研究证明除了预防作用，TLR4 和 TLR9 介导的信号还能逆转 Th2 型免疫应答的建立。然而 LPS 的构成是十分复杂的，关于 LPS 对变态反应性疾病的发展和在 Th2应答中的

130、作用仍存在大量的争论。 一些研究发现 LPS 在敏感的小鼠中要么对Th2 应答没有影响，要么刺激特殊变应原的 Th2 应答，这可能与 LPS 的剂量 43 和暴露时间有关。 这一结论在小鼠 LPS 作为肺传导抗原的佐剂研究中得到证明。当 LPS 低剂量时能引起伴有肺嗜酸性粒细胞、高血清 IgE、IL-4 、IL-5 和 IL-13 水平升高的变应原特异性 Th2 应答， 而 LPS 高剂量能引起伴有中性粒细胞和 IgG2a 抗体产生的 Th1 应答。LPS 诱导的 Th2 活性(高剂量 LPS 诱导 Th1 应答)是由 TLR4 介导的，因为 TLR4 缺陷小鼠没有显示 Th2 型应答的能力，

131、而且不同剂量的 LPS 调节了 TLR4 的激活，并且被诱导的特殊信号途径能直接诱导随后的适应性免疫应答是 Th1 还是 Th2 型。 这一观点被 LPS刺激 MyD88 缺陷树突状细胞导致 CD4+T 细胞产生 Th2 型变态反应所证实，并且是在缺乏 Th1 应答基础上独立发生的，所以非依赖 MyD88 途径可能调控了对 LPS 的 Th2 型免疫应答的发展。 研究证明 TLR4 对适宜的Th2 型免疫应答是必需的。 与野生型小鼠相比，尽管 TLR4 缺陷小鼠 Th2 型免疫应答较弱，但它们仍可以进行一定程度的Th2 型应答。导致 Th2 型免疫应答减弱的部分原因是由于缺乏 TLR4，使树突

132、状细胞成熟无能。尽管在不同组织树突状细胞的数量和它们的基本表型是一样的， 但在 TL4 缺陷的树突状细胞其共刺激分子的表达和 IL-12 的产生降低了 CD40 的激活一个非依赖 LPS 诱导的 TLR4 激活途径，而且与随后的刺激相比，CD4+T 细胞最初被 TLR4 缺陷的树突状细胞刺激产生较少的IL-4 和 IL-5，这表明减弱了 Th2 型应答的发展。最后在小鼠肺内给予 TLR4缺陷的树突状细胞减弱了体内的炎症， 这说明在缺乏 TLR4 信号时树突状细胞成熟完全无能，并且导致 Th2 型免疫应答的全部潜能丧失。 5、TLRs 与与与与 HIV-1 目前关于 HIV 和 TLRs 相关性

133、的研究刚刚起步，内容涉及 TLRs 介导的病毒侵入宿主细胞、TLRs 对 HIV-1 核酸刺激的反应性、抗病毒药物与 TLRs相关性免疫作用机制、TLRs 作为免疫佐剂等。Beignon AS 等117研究发现 44 HIV 激活 pDC 产生 IFN- 需要至少两种细胞和病毒间的反应，一是 CD4+ T细胞介导 HIV 内吞，二是内体的病毒核酸，如 RNA 通过 TLRs 激活 pDC，这种激活效应具有可重复性，并可被 TLRs 配体阻断。最后通过基因互补实验，确定 TLR7 是最重要的靶位分子。Heil F118研究发现源于 HIV-1 的富含GU 的 ssRNA 寡核苷酸可以刺激 DC

134、和巨噬细胞分泌 IFN- 和炎症性及调节性细胞因子，通过利用 TLR 缺陷小鼠和基因互补技术，发现鼠 TLR7 和人TLR8 可以介导种属特异性富含 GU 的 ssRNA 寡核苷酸的识别， 表明 ssRNA可作为 TLR7、 8 的生理学配体。 Equils119等研究发现蛋白酶抑制剂抑制 HIV复制的机制除了直接抑制 HIV 蛋白酶外，还可抑制 TLR 和 TNF- 介导的NF-B 激活和炎症性细胞因子产生，提示 PI 抗 HIV 感染的新的免疫调节效应。Wille-Reece 等120,121等观察在鼠类和灵长类动物，TLR7/8 激动剂 R-848或 TLR9 配体 CpG ODN 可作

135、为 HIV-1gag 蛋白的疫苗佐剂诱导 HIV-1gag 特异性 T 细胞反应和抗体产生，并可产生高水平的炎症性细胞因子，进而影响细胞免疫反应的强度和质量(主要是 Gag 特异性的 TH1 和抗体产生)， 并可刺激广泛的适应性免疫反应，因此可作为诱导强有力的初级免疫反应的疫苗佐剂。综上所述，可以认为模式识别受体 TLRs 在 HIV-1 的自然感染过程中起作用，但其具体功能以及和 HIV-1 感染的关系尚不明了。 总之，免疫因素在 HIV-1 感染致病的过程中发挥了作用。TLRs 作为重要的免疫分子，参与了多种病毒的感染过程。以 TLRs 为切入点，研究 TLRs在 HIV-1 感染者 CD

136、8+T 淋巴细胞的表达、功能，以期更好的理解 HIV-1 感染的自然过程，为研制新型 HIV-1 疫苗和抑制剂提供依据。 45 正正正正 文文文文 实验一实验一实验一实验一 HIV-1 感染者感染者感染者感染者 CD8+T 细胞中细胞中细胞中细胞中 TLRs 表达的研究表达的研究表达的研究表达的研究 1 材料材料材料材料 1.1 主要仪器主要仪器主要仪器主要仪器 TGL-16G 台式高速离心机 上海医用分析仪器厂 BH-2 荧光显微镜 日本 OLYMPUS HERAEUS CO2孵箱 德国 HERACELL 公司 SORVALL 台式低温离心机 美国 Kendro 公司 SANYO-70超低温

137、冰箱 日本 SANYO 公司 SCOTSMAN 制冰机 英国 SCOTSMAN 公司 Millipore 纯水仪 美国 Millipore 公司 净化工作台 苏州净化设备公司 SG403 生物安全柜 美国造鑫公司 液氮储存罐 美国 ELECTRON 公司 流式细胞仪 美国 BD 公司 Lightcycler 荧光 PCR 检测仪 瑞士 Roche 公司 SPECORD 40 紫外分光光度仪 英国 analyticjena 公司 1.2 主要溶液主要溶液主要溶液主要溶液 1.双抗液 配制青霉素、链霉素20万U/mL，使用时使终浓度达100U/mL，4保存。 NaCl 8.0g KCl 0.2g

138、2. PBS 液 Na2HPO4.12H2O 2.8g 46 KH2PO4.2H2O 0.2g 加三蒸水调pH至7.2，定容至1L高压灭菌。 PBS 1000ml 葡萄糖 20g（终浓度2%） 甲醛 10ml 3. 固定液 NaN3 0.2g（终浓度0.02%） PBS 900ml FCS 50ml（终浓度5%） 4. 洗涤液 4%NaN3 50ml（终浓度0.2%） RPMI1640 95ml 0.1M丙酮酸钠 1ml 0.2M谷氨酰胺 1ml 1M Hepes 1ml 7.5%NaHCO3 1ml 青霉素、链霉素 1ml 5. 不完全 RPMI 1640 培养液 （各1万单位） 不完全16

139、40培养液 90ml 6.完全 RPMI 1640 培养液 灭活胎牛血清 10ml NaCl 8.00g KCl 0.40g CaCl2 0.14g MgSO4 7H2O 0.20g Na2HPO4 H2O 0.06g KH2PO4 0.06g NaHCO3 0.35g 葡萄糖 1.00g 酚红 0.02g 7.Hanks 液 双蒸水 至1000ml 47 1.3 主主主主要试剂要试剂要试剂要试剂 富集 CD8+T 细胞抗体混合物 加拿大 RosetteSep 公司 荧光标记 CD3/CD4/CD8 单抗 美国 BD 公司 病毒载量检测试剂盒 瑞士 Roche 公司 DMSO 美国 Sigma

140、 公司 FCS 美国 GIBCO 公司 FITC 标记羊抗人 IgG 二抗 华美公司 TLR7 抗体 美国 Abcam 公司 Reverse Transcriptase Kit 大连 TaKaRa 公司 RPMI-1640 培养基 美国 GIBCO 公司 TRIZOL 试剂 美国 GIBCO BRL 公司 TLR4 抗体 美国 Abcam 公司 TLR5 抗体 美国 Abcam 公司 1.4 引物设计引物设计引物设计引物设计 参照 GenBank 公布的 TLR4、TLR5、TLR7 核苷酸序列，借助于计算机软件 Primer Premier 5.0 分别设计了上述序列的引物，引物由大连 Ta

141、KaRa 公司合成，以 GAPDH 作为内参照，引物序列见表 2。 2 TLRs? Tab. 2. Primers for PCR amplification of TLRs and GAPDH Gene name Primer sequence TLR4(NM-138554) Forward: 5-AGGATGATGCCAGGATGATGTC-3 Reverse: 5-TCAGGTCCAGGTTCTTGGTTGAG-3 TLR5(NM-003268) Forward: 5-CAGTATTTGAGGTGGCCTGAGGA-3 Reverse: 5-GTTGCTACAGTTTGCAACGG AA

142、TG-3 TLR7 (NM-016562) Forward: 5-CAATTGCTTCCGTGTCATCCAG-3 Reverse: 5-TCCCTATGGAACCCAGAAGCAG-3 GAPDH Forward: 5-CGGGAAACTGTGGCG TGAT-3 Reverse: 5- CATGGCAACTGATGAGGAGGG-3 48 1.5 研究对象 依据 2002 年国家卫生部制定的 HIV/AIDS 诊断标准，选取第四军医大学唐都医院感染病科门诊和住院的 HIV-1 感染者共 31 例（均签署知情同意书） ，另以 20 例健康人作为对照组。 2 方法方法方法方法 2.1 CD4+

143、T/CD8+T 细胞绝对计数的检测 (1) 开机：检查鞘液桶和废液桶，打开流式细胞仪，打开电脑，气压阀置于加压位置，排除管道中气泡，做 prime，机器预热 510min 后开始实验； (2) 加显色剂：在 Trucount 中加入 CD4+/CD8+/CD3+显色剂 20l； (3) 加 50l 抗凝血； (4) 2025避光孵育 15min； (5) 加红细胞裂解液（1 x FACS lysing solution）450l； (6) 2025避光孵育 15min 后上机； (7) Mutifulof 软件分析。 2.2 HIV PCR 荧光定量检测 (1) 取n个0.5ml灭菌离心管 （

144、n=样本数1管阳性对照1管阴性对照） ，做好标记； (2) 在上述每管中加入 150l 裂解液，然后加入待测样本和阴性对照50l，阳性对照管中先加入阳性对照 25l，然后加入阴性对照管中的血浆 25l，用吸头反复吸打混匀（一份样本换用一个吸头），再加入 50l 氯仿，混匀器上振荡混匀 5s； (3) 13，000rpm，4离心 15min； (4) 取同步骤 1 相同数量的 0.5ml 灭菌离心管，各加入 100l 异丙醇和2lRNasin，做好标记。吸取步骤 3 各管中的上层液相转移至相应的 49 管中，颠倒混匀； (5) 13，000rpm 离心 10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，

145、沾干液体，加入 300l75乙醇，颠倒洗涤； (6) 13，000rpm 离心 10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体； (7) 4，000rpm 离心 5s，将管壁上的残余液体甩到管底，用微量加样器尽量吸干； (8) 加入 15lDEPC 水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2，000rpm 离心 5s，冰上保存备用； (9) 从试剂盒中取出 HIV RT-PCR 反应液，PCR Enhancer，在温室下融化混匀，2，000rpm 离心 10s； （10）取 Roche 专用毛细管 n 个（n=样本数1 管阳性对照管1 管阴性对照管4 管校准品），按配制的反应液加入毛细管（配制

146、：HIV RT-PCR 反应液:PCR Enhancer9.8:0.2）； （11）向配制好的混和液中加 n/2 个 RT-PCR 颗粒酶，混匀，2，000rpm 离心10s； （12）向毛细离心管中每管加 10l 反应混和液； （13）加入步骤 8 制备的 RNA 溶解液和标准品各 15l，盖紧管盖，连同Roche 专用金属反应管套放在离心机中，2，000rpm 离心 10s。将毛细管排好放入荧光 PCR 检测仪内，记录标本排放顺序； （14）设置循环条件： Program Cycles Temperature () Incubation Time(min:sec) 1 1 42 30:00

147、 2 1 92 3:00 3 5 92 :10 52 :20 72 :30 4 40 92 :5 60 :30 50 （15）Roche 荧光 PCR 检测仪自动分析。 2.3 CD8+T 细胞的纯化 (1) 取 EDTA 抗凝外周静脉血 30ml，转移至无菌 50ml 离心管中； (2) 每 ml 全血样品中加入 50lRosetteSep 富集 CD8+T 细胞抗体混合物，充分混匀； (3) 在室温中孵育 20 分钟 (4) 以等体积的含 2%胎牛血清的 PBS 稀释样品，并缓慢混匀； (5) 取 2 个 50ml 离心管，每管加入 15ml 分离液； (6) 将离心管倾斜 30，沿管壁缓

148、缓加入稀释后的静脉血 30ml； (7) 室温下 1200g 离心 20 分钟（采用缓慢升降档） ； (8) 离心管内分为 3 层，先吸弃上层 PBS 液，将吸管插到云雾层小心吸取并转移入另一离心管； (9) 用 PBS 液离心洗涤细胞两次， 第二次洗涤之后吸弃上清， 加入含 10%胎牛血清的完全 RPMI1640 培养液 10ml，用台盼蓝染色计数，并调整细胞的密度至 1.0106个/ml。 2.4 流式细胞术确定 CD8+T 细胞的纯度 (1) FACS 管中加入细胞悬液 0.5ml（细胞数为 5105），1,500 rpm 离心10 min； (2) 弃上清，加入 APC-CD8 抗体

149、2l； (3) 4 避光孵育 30min； (4) 用 PBS 离心洗涤细胞 1 次； (5) 弃上清，加入 200l 鞘液，上流式细胞仪分析。 2.5 提取细胞总 RNA (1) 取 3106细胞，用 PBS 清洗 2 次，去其上清，加入 TRIZOL 0.5 mL，摇匀，消化 3-5 min； (2) 将消化好的细胞裂解液吸到 DEPC 处理过的 1.5 mL 离心管中，加新 51 打开的氯仿 0.2 mL，轻摇 15s； (3) 室温静置 23 min 后，12，000 rpm，15 min，4离心。然后取上清无色水相(约 0.6 mL)到 DEPC 处理过的离心管中，加等体积异丙醇，室

150、温下静置 10 min； (4) 12，000 rpm，10 min，4，离心。观察总 RNA 在管底的白色沉淀，弃去上清，用 DEPC 水新鲜配制的 75%乙醇 1.0 mL 洗涤后，7,500 rpm，5 min，4 离心； (5) 去上清，点离，用小 Tip 吸干液体。放置 510 min 后，DEPC 处理水 2030 L 加入，混匀，5560 水浴 10 min 溶解总 RNA，用紫外分光光度计，测 OD 值，所有样本的 OD260/OD280比值要求在1.751.95 之间。低于此值者表明其含有蛋白质杂志，用氯仿重新提纯。RNA 样品-70保存备用。 2.6 模板的制备 在冰上配置

151、 RT 反应液 5PrimeScript Buffer 2 L PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 L 50M Oligo-dT primer 0.5L 100M Random 6 mers 0.5 L RNA RNase-free water 6.5 L Total volume 10 L 反应条件：37 15min 85 5sec 合成的 cDNA 作为 PCR 扩增的模板，-20保存。 2.7 实时荧光定量 PCR 反应 (1) 配置 PCR 反应液（在冰上进行） 52 (2) 取 Roche 专用毛细管，将配制的反应液加入毛细管； (3) 盖紧管盖，连同 Roc

152、he 专用金属反应管套放在离心机中，2，000rpm离心 10s； (4) 将毛细管排好放入荧光 PCR 检测仪内，记录标本排放顺序； (5) 设置循环条件： Stage 1： 95 10s 20/s 1 Cycle Stage 2： 95 5s 20/s 60 20s 20/s 40 Cycles Stage 3： 95 0s 20/s 65 15s 20/s 95 0s 0.1/s (6) GAPDH 作为内参照与 TLRs 同时行 PCR 反应，并于反应结束后一起分析结果。用 LightCycler 荧光定量 PCR 扩增仪进行 PCR 反应，在 PCR 反应的同时， 每扩增 1 次循环

153、， 检测 1 次 PCR 产物量(荧光强度变化)。所有的反应产物均被 Light Cycler 扩增仪收集，并储存于其附件(电脑)及相应的分析软件中。按照下列公式计算样本中TLR4、TLR5、TLR7mRNA 的相对表达量122：C t（目的基因）=目的基因 Ct-内对照基因 Ct，C t=C t（目的基因）-C t（标准值） ，目的基因的相对总量为 2-Ct。Ct 值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，Ct 值与 TLR4、TLR5、SYBR Premix Ex Tag 10 L PCR Forward Primer 0.4 L PCR Reverse Primer 0

154、.4L 模板（cDNA）溶液 2 L dH2O 7.2 L Total volume 20 L 53 TLR7mRNA 的表达水平呈负相关，即 Ct 值增加，表示 TLRsmRNA 水平下降。 所有样本均重复三次。 2.8 间接免疫荧光染色和 FCM 分析 (1) 取两个 FACS 管， 每管中加入 1mlCD8+T 细胞悬液 （细胞数 1106） ，1500rpm 离心 10 分钟，弃上清； (2) 用 10%FCS RPMI 1640 调整细胞至 100l； (3) 一管加入表面抗体抗-CD8-APC2l，4避光孵育 10min；另一管不加抗体，作为阴性对照； (4) 用洗涤液洗涤 2 次

155、，每次加洗涤液 2ml，1000rpm 离心 5min； (5) 加入固定液 2ml，4避光孵育 10min，1000rpm 离心 5min，弃上清； (6) 加入 500l 破膜剂，4避光孵育 10min； (7) 用洗涤液洗涤 2 次，每次加洗涤液 2ml，1000rpm 离心 5min； (8) 加入山羊血清 5l，充分混匀， 4孵育 10min； (9) 将 FACS 管置于冰上，加入 TLR7 抗体 4l，孵育 30min； (10)用洗涤液洗涤 2 次，每次加洗涤液 2ml，1000rpm 离心 5min； (11)弃上清， 每管中加入 50l FITC 标记羊抗人 IgG 抗体，

156、 充分混匀， 4孵育 30min； (12)用洗涤液洗涤 2 次，每次加液 2ml，1000rpm 离心 5min； (13)弃上清，加入 200l 鞘液，上流式细胞仪分析。 2.9 统计学处理 采用SPSS13.0软件对研究结果进行分析，分别用Spearman秩相关来进行TLRs表达同病毒载量、CD4+T细胞计数相关性的分析；样本间比较采用t检验。P0.05具有统计学意义。 54 3 结果结果结果结果 3.1 HIV-1 感染者的临床特征感染者的临床特征感染者的临床特征感染者的临床特征 31例HIV-1感染者的平均年龄为42岁（22-66岁） ，其中男性20名，女性11名。 有18名HIV-

157、1感染者接受过HAART治疗， 13名感染者没有接受过治疗。接受HAART治疗的HIV-1感染者CD4+T细胞计数为287-806106cells/L；CD8+T细胞计数为440-1069106cells/L； 病毒载量为50-21,250copies/ml。 未接受HAART治疗的HIV-1感染者CD4+T细胞计数为13-951106cells/L； CD8+T细胞计数为267-2342106cells/L；病毒载量为753-8,815,000copies/ml。 3.2 HIV-1感染者CD8+T细胞上TLRsmRNA表达水平的变化 经纯化后，CD8+T细胞的纯度均99%。采用相对定量法2

158、-CT公式分析正常人和HIV-1感染者外周血CD8+T细胞上TLR4、TLR5和TLR7mRNA的表达差异，以正常人外周血CD8+T细胞上TLR4、TLR5和TLR7mRNA的表达量作为标准，在此基础上比较HIV-1感染者外周血CD8+T细胞上TLR4、TLR5和TLR7mRNA的相对表达量，见表3、4、5，图5、6、7、8。HIV-1感染者和正常人外周血CD8+T细胞上TLR4、TLR5mRNA的表达无显著差异（P0.05） ，但HIV-1感染者外周血CD8+T细胞上TLR7mRNA的表达显著高于其在正常人CD8+T细胞上的表达（P0.05） 。 3TLR4mRNAHIV-1 !#$ !#$

159、 !#$ !#$CD8+T%&()*+%&()*+%&()*+%&()*+ Tab.3:The expression of TLR4 mRNA on CD8+T cells in HIV-1 infected individuals and healthy controls 组别 例数 CT P值 HIV-1感染者 31 10.263.81 正常人 20 10.954.01 P0.05 55 4TLR5mRNAHIV-1 !#$ !#$ !#$ !#$CD8+T%&()*+%&()*+%&()*+%&()*+ Tab.4: The expression of TLR5 mRNA on CD8+

160、T cells in HIV-1 infected individuals and healthy controls 组别 例数 CT P值 HIV-1感染者 31 9.943.84 正常人 20 11.052.98 P0.05 5TLR7mRNAHIV-1 !#$ !#$ !#$ !#$CD8+T%&()*+%&()*+%&()*+%&()*+ Tab.5: The expression of TLR7 mRNA in CD8+T cells in HIV-1 infected individuals and healthy controls 组别 例数 CT P值 HIV-1感染者 31

161、6.703.11 正常人 20 11.802.22 P0.05 ,5TLR4mRNAHIV-1 !#$ !#$ !#$ !#$CD8+T%&()*+%&()*+%&()*+%&()*+ Fig.5: The expression of TLR4 mRNA on CD8+T cells in HIV-1 infected individuals and healthy controls 56 ,6TLR5mRNAHIV-1 !#$ !#$ !#$ !#$CD8+T%&()*+%&()*+%&()*+%&()*+ Fig.6: The expression of TLR5 mRNA on CD8+

162、T cells in HIV-1 infected individuals and healthy controls ,7TLR7mRNAHIV-1 !#$ !#$ !#$ !#$CD8+T%&()*+%&()*+%&()*+%&()*+ Fig.7: The expression of TLR7 mRNA on CD8+T cells in HIV-1 infected individuals and healthy controls 57 ,8TLR4-5-7mRNA./01./01./01./01RT-PCR2345,2345,2345,2345,.A:TLR4;B:TLR5;C:TLR

163、7 Fig.8:RT-PCR curve of TLR4-TLR5-TLR7. A:TLR4;B:TLR5;C:TLR7 A B C 58 3.3 HIV-1感染者CD8+T细胞上TLRs蛋白表达水平的变化 为进一步证实 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞上 TLR7 的表达差异， 采用流式细胞术检测正常人和 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞上 TLR7 蛋白水平的表达。HIV-1感染者CD8+T细胞上TLR7蛋白水平的表达 （荧光强度： 288.8163.11）显著高于其在正常人 CD8+T 细胞（荧光强度：131.9552.38）上的表达（P0.05） ，见图 9。该结果进一步证实了

164、 HIV-1 感染者和正常人 CD8+T 细胞上 TLR7 的表达差异。 HIV-1(n=31)healthy control(n=20)050100150200250300350Aexpression of TLR7at protein level,MFI ,9HIV-1 !#$ !#$ !#$ !#$CD8+T%&%&%&%&TLR76767676789898989()()()() Fig.9The expression of TLR7 protein in CD8+T cells in HIV-1 infected individuals and healthy controls 59

165、3.4 TLR7 表达与表达与表达与表达与 CD4+T 细胞细胞细胞细胞计数计数计数计数、病毒载量及病毒载量及病毒载量及病毒载量及 HAART 治疗的关系治疗的关系治疗的关系治疗的关系 采用 Spearman 秩相关法，分析 TLR7 表达与 CD4+T 细胞计数及病毒载量的关系。结果显示 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞上 TLR7 的表达与 CD4+T 细胞计数、 病毒载量均无明显相关性 （P0.05） 。 根据 CD4 细胞计数 （200cells/l和105copies/ml 和0.05） 。 4 讨论讨论讨论讨论 CD8+T 细胞对控制 HIV-1 感染和病毒复制起关键作用， 它

166、所介导的 CTL反应是机体针对 HIV-1 的主要效应武器。其直接证据是随着 HIV-1 特异性CTL 反应的扩大，HIV-1 病毒血症逐渐被控制。CD8+T 细胞可通过以下几个方式控制 HIV-1 复制。首先，CD8+T 细胞可以和靶细胞表面 MHC 呈递的病毒多肽结合，释放穿孔素、粒酶，引起溶细胞效应，从而破坏产毒靶细胞；第二，CD8+T 细胞可表达 Fas 配体，和靶细胞表面的 CD95 结合，导致细胞凋亡；第三，CD8+T 细胞可释放一些可溶性抗病毒因子，如 IFN-，通过一系列复杂的受体介导的结合、 激活， 使附近细胞抵抗病毒感染； 第四， CD8+T细胞可产生 趋化因子，和 HIV

167、-1 辅受体 CCR5 结合，使细胞内化，导致HIV-1 无法结合和感染靶细胞。 此外， CD8+T 细胞还可表达许多抗病毒因子，如细胞抗病毒因子（cell antiviral factor,CAF）等。这些证据均提示 CD8+T 细胞在控制 HIV-1 感染中起重要作用，但其具体机制尚未完全阐明。因此，本研究以 CD8+T 细胞作为研究的靶细胞。 模式识别受体能特异性地识别病原微生物进化过程中保守的抗原分子，即病原相关分子模式，从而有效地监测病原微生物的入侵以及诱导机体产生免疫应答反应123。Toll 样受体就是一种模式识别受体，它可识别病原微生物进化过程中的保守分子，如脂多糖(LPS)、肽

168、聚糖、酵母多糖以及病原微生物的核酸等等。脂多糖受体 TLR4 是发现的第一个 TLR，目前已经陆续发现了十余种 TLRs。它们可表达于体内多种细胞，如巨噬细胞、树突状细胞、B 细 60 胞等； 在一些非免疫系统细胞中 TLRs 也可表达， 如成纤维细胞、 上皮细胞等。此外， TLRs 在细胞内、 外均可表达。 其中， TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 和 TLR6表达于细胞表面，而 TLR3、TLR7、TLR8 和 TLR9 则几乎都在细胞内表达。 TLRs 在启动固有免疫过程中起重要作用。既往研究表明通过固有免疫应答，TLRs 可间接调节适应性免疫反应。由于固有免疫细胞是机体抵抗

169、微生物感染的第一道防线，因此对 TLRs 的研究最初主要着眼于这些细胞。但是，越来越多的证据表明，适应性免疫细胞如 T 细胞等也可表达 TLRs，并能通过 TLR 信号途径调节其功能102,103,124-126。 如 TLR9 配体 CpG 可调节 Th1型细胞反应127:128；TLR5 和 TLR7 可在人 CD4+T 细胞中表达，其配体可促进 CD4+T 细胞增殖及产生细胞因子103。 TLRs 在许多病毒的致病过程中起重要作用，如呼吸道肠道病毒、柯萨奇病毒、 呼吸道合胞病毒等129-132。 Keigo Machida 等发现 TLR4 是引起 HCV致病的重要分子133。越来越多的

170、证据表明，TLRs 与 HIV-1 感染也有密切关系。如 TLR2、4、9 可以增强转基因小鼠细胞上 HIV-1 的复制134-136；HIV感染者单核细胞中 TLR2 的表达显著增高，并且 TLR2 表达的增高与 gp120蛋白密切相关137；TLR7/8 的配体具有抗 HIV-1 复制的活性。这些研究均提示 TLRs 与 HIV-1 有一定关系。 但是， HIV-1 感染过程中 CD8+T 细胞中 TLRs的表达及功能的研究尚未见报道。因此，本研究首先探讨了 HIV-1 感染过程中 CD8+T 细胞中 TLR4、TLR5 和 TLR7 的表达。既往研究发现人外周血 T淋巴细胞表达 TLR

171、mRNA。CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞可在蛋白或基因水平表达 TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8 和 TLR9。本研究证实人外周血 CD8+T 细胞中 TLR4、TLR5 和 TLR7 均可表达，该结果与国外文献报道一致。此外，我们首次发现了 HIV-1 感染者外周血 CD8+T 细胞中 TLR7的表达显著高于其在正常人 CD8+T 细胞中的表达，提示在 HIV-1 感染过程中 TLRs 的表达发生了改变。但是，TLR7 表达与 CD4+T 细胞计数、病毒载量及 HAART 治疗均无显著的相关性。这些结果提示，在 HIV-1 感染过程中TLR7 的表达显著增高，

172、但其具体机制仍需进一步研究。 61 实验二实验二实验二实验二 TLR7配体配体配体配体诱导诱导诱导诱导CD8+T细胞活化及细胞因子产生细胞活化及细胞因子产生细胞活化及细胞因子产生细胞活化及细胞因子产生 1 材材材材 料料料料 1.1 主要仪器 TGL-16G 台式高速离心机 上海医用分析仪器厂 BH-2 荧光显微镜 日本 OLYMPUS HERAEUS CO2孵箱 德国 HERACELL 公司 SORVALL 台式低温离心机 美国 Kendro 公司 SANYO-70超低温冰箱 日本 SANYO 公司 SCOTSMAN 制冰机 英国 SCOTSMAN 公司 Millipore 纯水仪 美国 M

173、illipore 公司 净化工作台 苏州净化设备公司 SG403 生物安全柜 美国造鑫公司 液氮储存罐 美国 ELECTRON 公司 流式细胞仪 美国 BD 公司 Lightcycler 荧光 PCR 检测仪 瑞士 Roche 公司 1.2 主要试剂 富集 CD8+T 细胞抗体混合物 加拿大 RosetteSep 公司 DMSO 美国 Sigma 公司 FCS 美国 GIBCO 公司 RPMI-1640 培养基 美国 GIBCO 公司 CL097（Imidazoquinoline） 美国 Invivogen 公司 淋巴细胞分离液 美国 Sigma 公司 佛波酯（PMA） 美国 Sigma 公司

174、 ;?ABCDE F62F 伊屋诺霉素（Ionomycin） 美国 Sigma 公司 布雷菲德菌素 A（Brefeldin A) 美国 Sigma 公司 APC 标记抗-CD8 单抗 美国 BD 公司 FITC 标记抗-IFN- 单抗 美国 BD 公司 破膜固定液 美国 Caltag 公司 Trucount 绝对计数管 美国 BD 公司 PE 标记抗-CD69 单抗 美国 BD 公司 PE 标记抗-IL-2 单抗 美国 BD 公司 2.方法方法方法方法 2.1 外周血单核细胞（PBMC）的分离 (1) 取 EDTA 抗凝外周静脉血 30ml，转移至无菌 50ml 离心管中； (2) 加等量无菌

175、 Hanks 液稀释； (3) 取 2 个 50ml 离心管，每管加入 15ml 分离液； (4) 将离心管倾斜 30，沿管壁缓缓加入稀释后的静脉血 30ml； (5) 2320 rpm 离心 20 min（采用缓慢升降档）后，离心管内分为 3 层，上层为 Hanks 液和血浆，下层主要为红细胞和粒细胞，中间有一个白色云雾状狭窄带即为实验所需的外周血单核细胞。先吸弃上层Hanks 液，将吸管插到云雾层小心吸取并转移入另一离心管； (6) 用 Hanks 液离心洗涤细胞两次，第二次洗涤之后吸弃上清，加入含10%胎牛血清的完全 RPMI1640 培养液 10ml，用台盼蓝染色计数，并调整细胞的密度

176、至 1.0106个/ml。 2.2 流式细胞术检测 TLR 配体对纯化 CD8+T 细胞表面 CD69 表达的影响 (1) 分离 HIV-1 感染者和正常人外周血 CD8+T 细胞， 调整细胞浓度为 10个/ml； ;?ABCDE F63F (2)每管加入1mlCD8+T细胞， 分别加入三种浓度的TLR7配体CL097 （0.5、1、5g/ml），另取两管细胞，其中一管加入 20lPMA(1g/ml)和 20l Iono(50g/ml),作为阳性对照；另一管不加配体，作为阴性对照； (3)37，5%CO2孵育 6h； (4)每管加入 2ml 含 1%FCS 的 PBS 洗涤，1500 rpm，

177、410 min； (5)每管加入 3l 抗-CD69-PE 和 2l 抗-CD8-APC, 4避光 30 min； (6)2mlPBS1500 rpm，410 min 洗涤； (7)200lPBS 重悬； (8)上机，Cellquest 软件分析。 2.3 流式细胞术检测TLR配体对PBMC中CD8+T细胞表面CD69表达的影响 (1)分离 HIV-1 感染者 PBMC，调整细胞浓度为 106个/ml； (2)每管加入 1mlPBMC， 分别加入三种浓度的 TLR7 配体 CL097 （0.5、 1、5g/ml），另取两管细胞，其中一管加入 20lPMA(1g/ml)和 20l Iono(50

178、g/ml)，作为阳性对照；另一管不加配体，作为阴性对照； (3)37，5%CO2孵育 6h； (4)每管加入 2ml 含 1%FCS 的 PBS 洗涤，1500 rpm，410 min； (5)每管加入 3l 抗-CD69-PE 和 2l 抗-CD8-APC, 4避光 30 min； (6)2mlPBS1500 rpm，410 min 洗涤； (7)300lPBS 重悬； (8)上机，Cellquest 软件分析。 2.4 细胞内细胞因子染色方法（ICS）检测检测检测检测 TLR7 配体对纯化 CD8+T 细胞分泌细胞因子的影响 (1)分离 HIV-1 感染者和正常人纯化 CD8+T 细胞，调

179、整细胞浓度为 106个/ml； ;?ABCDE F64F (2)每管加入1mlCD8+T细胞， 分别加入三种浓度的TLR7配体CL097 （0.5、1、5g/ml），另取两管细胞，其中一管加入 20lPMA(1g/ml)和 20l Iono(50g/ml)，作为阳性对照；另一管不加配体，作为阴性对照； (3)37，5%CO2孵育 1h； (4)每管加入 10l1mg/ml Brefeldin A； (5)37，5%CO2孵育 4-5h； (6)用 2ml 含 1%FCS 的 PBS 洗涤，1500 rpm，410 min； (7)加入 2l 抗-CD8-APC，充分混匀，4孵育 30 min；

180、 (8)加入 2mlPBS，1500 rpm、410 min 洗涤； (9)每管加入 100l 破膜固定液 A； (10)室温避光放置 15min； (11)2mlPBS1700 rpm，47 min 洗涤； (12)加入100l破膜固定液B， 同时加入抗IFN-FITC 3l、 抗IL-2-PE 5l； (13)室温避光放置 20min； (14)2mlPBS1700 rpm，47 min 洗涤； (15)200lPBS 重悬； (16)上机，Cellquest 软件分析。 2.5 ICS 检测检测检测检测 TLR7 配体对 PBMC 中 CD8+T 细胞分泌细胞因子的影响 (1)分离 HI

181、V-1 感染者 PBMC，调整细胞浓度为 106个/ml； (2)每管加入 1mlPBMC，分别加入三种浓度的 TLR7 配体 CL097（0.5、1、5g/ml），另取两管细胞，其中一管加入 20lPMA(1g/ml)和 20l Iono(50g/ml)，作为阳性对照；另一管不加配体，作为阴性对照； (3)37，5%CO2孵育 1h； (4)每管加入 10l1mg/ml Brefeldin A； (5)37，5%CO2孵育 4-5h； ;?ABCDE F65F (6)用 2ml 含 1%FCS 的 PBS 洗涤，1500 rpm，410 min； (7)加入 2l 抗-CD8-APC，充分混

182、匀，4孵育 30 min； (8)加入 2mlPBS，1500 rpm、410 min 洗涤； (9)每管加入 100l 破膜固定液 A； (10)室温避光放置 15min； (11)2mlPBS1700 rpm，4、7 min 洗涤； (12)加入100l破膜固定液B， 同时加入抗IFN-FITC 3l、 抗IL-2-PE 5l； (13)室温避光放置 20min； (14)2mlPBS1700 rpm，4、7 min 洗涤； (15)200lPBS 重悬； (16)上机，Cellquest 软件分析。 2.6 统计学处理 采用SPSS13.0软件对研究结果进行分析， 组间比较采用独立样本t

183、检验，以 P0.05 为具有统计学意义。 3 结果结果结果结果 3.1 纯化 CD8+T 细胞表面 CD69 的表达 某些细胞表面分子如CD69 等在 T 细胞活化后显著增高， 因此是 T 细胞早期活化的标志138-141。为了探讨TLR7 配体 CL097 对CD8+T 细胞的活化作用，本研究检测了31例HIV-1感染者和20例正常人CD8+T细胞表面CD69的表达，我们发现经过0.5、 1 和5g/ml CL097 刺激6h 后， HIV-1 感染者和正常人CD8+T细胞表面 CD69 的表达均显著增高(P0.05)，但 CD69 在 HIV-1 感染者 CD8+T细胞表面的表达 （见图1

184、0、 11） 高于其在正常人CD8+T细胞表面的表达(P0.05)。此外，CL097 对 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞的活化作用呈浓度依赖性，CL097浓度为 0.5g/ml 时，CD8+T 细胞表面CD69 的表达最高。 （见图 11） ;?ABCDE F66F A B GHIJKLMKLMGHIJ;?ABCDE F67F NNNN10:CL097OPQROPQROPQROPQRCD8+TSTUVSTUVSTUVSTUVCD69WUXWUXWUXWUX. A:YZYZYZYZB_Z_Z_Z_ZC:0.5g/mlCL097 Fig.10:Expression of CD69 on CD

185、8+T cells after stimulation with CL097 A:negative control;B:positive control;C: 0.5g/mlCL097 3.2 PBMC 中 CD8+T 细胞表面 CD69 的表达 为了探讨 CL097 对 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞的活化作用是否依赖于辅助细胞的帮助， 本研究检测了 0.5、 1、 5g/mlCL097 刺激 PBMC6h 后， CD8+T细胞表面 CD69 的表达。同样，经过不同浓度 CL097 刺激后，CD8+T 细胞表面 CD69 的表达亦显著增高(P0.05)，并且呈浓度依赖性。CL097 浓

186、度为0.5g/ml 时，CD8+T 细胞表面 CD69 的表达最高。但是，PBMC 中 CD8+T细胞表面 CD69的表达与纯化CD8+T细胞表面CD69 的表达无显著差异(P0.05)(见图 11、12)，提示 TLR7 配体可以辅助因子非依赖的形式活化 HIV-1感染者 CD8+T 细胞。 C KLMGHIJ;?ABCDE F68F NNNN11: CL097OPOPOPOP6hCD8+TSTaSTaSTaSTaCD69WUXbcWUXbcWUXbcWUXbc Fig.10: Expression of CD69 on CD8+ T cells following 6hr of stimu

187、lation with CL097 A GHIJKLM;?ABCDE F69F NNNN12CL097OPOPOPOPPBMCCD8+TSTUVSTUVSTUVSTUVCD69WUXWUXWUXWUX. A:YZYZYZYZB_Z_Z_Z_ZC:0.5g/mlCL097 Fig.12:Expression of CD69 on CD8+T cells following stimulation of PBMC with CL097 A:negative control;B:positive control;C: 0.5g/mlCL097 B C GHIJGHIJKLMKLM;?ABCDE F7

188、0F 3.3 CL097 对纯化 CD8+T 细胞分泌细胞因子的影响 为了探讨 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞中 TLR7 的高表达是否影响 CD8+T细胞的功能， 本研究采用细胞内细胞因子染色法检测了0.5、 1和5g/mlCL097刺激后， HIV-1 感染者和正常人 CD8+T 细胞 IL-2 和 IFN- 的分泌情况。 经过6h 或 20h 的刺激后， 0.5、 1 和 5g/ml 的 CL097 均不能刺激 CD8+T 细胞产生IL-2 和 IFN-，见图 13。 3.4 CL097 刺激 PBMC 中 CD8+T 细胞产生细胞因子的情况 使用不同浓度的 CL097（0.5、1

189、 和 5g/ml）刺激纯化的 CD8+T 细胞，无论孵育 6h 还是 20h，CD8+T 细胞均未能产生 IL-2 和 IFN-。为了探讨 CD8+T细胞在辅助因子的帮助下是否可产生细胞因子，本研究检测了 CL097 刺激HIV-1 感染者 PBMC 后，CD8+T 细胞分泌细胞因子的情况。我们发现经过 6h小时的孵育， 0.5、 1和5g/ml的CL097未能刺激CD8+T细胞产生IL-2和IFN-。延长孵育时间至 20h 后，CD8+T 细胞在不同浓度 CL097 的刺激下均能产生IFN-，并且 IFN- 的产生呈浓度依赖性。CL097 在 1g/ml 时，CD8+T 细胞产生 IFN-

190、达到最大值。但是，延长孵育时间至 20h 后，不同浓度的CL097 仍未能刺激 CD8+T 细胞产生 IL-2。这些研究提示，在 HIV-1 感染过程中，TLR7 配体可以辅助因子依赖的形式刺激CD8+T 细胞产生细胞因子。见图13、14。 NNNN13CL097OPOPOPOPCD8+ TSTdeSTdeSTdeSTdeIFN-fghfghfghfgh Fig.13: CD8+ T cells secreted IFN- following stimulation with CL097 for 20hr ijklmnopnqrs t71t A B uvwuvwxyz| 72 14:CL097

191、PBMCCD8+TIFN-. A:BC:1g/mlCL097 Fig.14:Secretion of IFN- by CD8+T cells after 20h stimulation of PBMC with CL097 A:negative control;B:positive control;C: 1g/mlCL097 4.讨论讨论讨论讨论 TLRs 及其配体相互作用后可调节树突状细胞142-145、单核细胞146,147以及 B 细胞、T 细胞148,149的功能，提示 TLRs 信号能直接激活并调节固有免疫和适应性免疫系统的细胞。TLRs 刺激后可引发 NF-B 或 IRF 的激活，

192、进而导致炎性因子和化学因子的产生以及共刺激分子的表达150。到目前为止，已发现表达于人类的 TLRs 有 11 种。其中，TLR1 识别脂质；TLR2 可识别多种细菌的 PAMPs，如肽聚糖、胞壁酸、脂蛋白等；TLR3 的配体可以是病毒的双链 RNA 或 PolyI:C；TLR4 可识别多种配体，如细菌脂多糖、热休克蛋白等；TLR5 的配体是鞭毛蛋白；TLR6 亦可识别脂质；TLR7/TLR8 识别病毒的单链 RNA 或咪唑并喹啉 （如 R-848） ； TLR9 的配体是非甲基化的 CpG C 73 DNA151。不同的 TLRs 与其配体结合后可产生不同的效应。 CL097 属于咪唑并喹啉

193、家族，具有强大的抗肿瘤、抗病毒的效应152。咪唑并喹啉家族成员可激活免疫反应,促使鼠类和人单核细胞产生 IL-12、IFN- 和 IFN- 等，并能引起 Th1 型细胞反应153。CL097 是 TLR7 的合成配体，在试验中便于使用。 CD69等标志性分子的表达增高是CD8+T细胞活化和增殖的标志154-157。近期研究发现，TLR 信号能增强 CD4+T 细胞表面活化标志物的表达158。我们发现 TLR7 配体 CL097 能显著增强 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞表面 CD69的表达，提示 TLR 信号与 HIV-1 感染过程中的免疫激活有一定关系。既往研究提示，免疫激活在 HIV

194、-1 发病过程中起重要作用159,160。HIV-1 自体成分能通过 TLR7、TLR8 引发强烈的免疫激活161，干扰 TLR 信号通路能阻断这种激活。 Angela 等161发现 HIV-1 基因组中富含尿嘧啶的单链 RNA 序列可作为 TLR7 的配体进而激活 CD8+T 细胞。 这些研究均提示 HIV-1 感染过程中异常的免疫激活与 TLR7 信号有一定关系。此外，HIV-1 感染者血中 LPS（TLR4 的配体） 的增多与增强的免疫激活密切相关162,163。 我们的研究和这些研究均提示 HIV-1 感染过程中 TLRs 在免疫激活过程中发挥重要作用。 TLRs 是连接固有免疫和适应

195、性免疫的重要桥梁，抗原提呈细胞在这一过程中起关键作用164。近年来，越来越多的证据表明，除了抗原提呈细胞介导的间接效应外，TLRs 亦可直接调节 T 细胞的功能。已有研究发现某些TLR 能在 CD4+T 细胞中表达，并具有一定的功能。本研究发现 TLR7 配体刺激后，纯化 CD8+T 细胞和 PBMC 中 CD8+T 细胞表面 CD69 的表达无显著差异，提示 TLR 信号可以辅助因子非依赖的方式改变 HIV-1 感染者 CD8+T细胞的活化状态。这一结果与以往研究一致，提示 TLRs 的配体可直接调节T 细胞。 TLRs 信号可引起复杂的改变进而导致细胞微环境发生变化，包括细胞因子的释放、细

196、胞激活和 MHC 分子的上调等165。其中，最主要的结果就是 74 引起细胞因子的分泌，如抗病毒因子 IFNs 等。许多研究表明适应性免疫细胞如 T 细胞等可表达 TLRs，TLRs 可调节这些细胞的功能，如产生 IFN- 等细胞因子。 尽管 CL097 能增加 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞表面 CD69 的表达，但本实验中我们未发现 CL097 能刺激纯化的 CD8+T 细胞产生 IFN- 和 IL-2。近期研究提示 TLR7 配体 R-848 能直接作用于 CD4+T 细胞， 增加 IFN- 的产生。与我们的研究结果相一致， Angela161等未能发现 TLR7 配体能直接作用于

197、 CD8+T 细胞使其产生 IFN- 和 IL-2。 这一作用的缺失可能与缺乏辅助因子有关。后续实验证实了这一假设。我们发现经 CL097 刺激后，HIV-1 感染者PBMC中的CD8+T细胞可产生IFN-。 本研究提示TLR7配体可刺激CD8+T细胞产生抗病毒免疫，并且 CL097 激活 CD8+T 细胞产生细胞因子的作用依赖于辅助因子的帮助。这一作用的具体机制需要进一步研究。 75 小小小小 结结结结 本研究采用实时定量 PCR 和流式细胞术，探讨了 31 例 HIV-1 感染者和20 例正常人 TLR4、 TLR5 和 TLR7 的表达情况， 并分析了 TLR7 配体 CL097对 HI

198、V-1 感染者 CD8+T 细胞的活化作用及细胞因子的分泌情况，结论如下： 1HIV-1 感染者 CD8+T 细胞中 TLR7mRNA 的表达显著增高，但 TLR4、TLR5mRNA 的表达未见明显异常。 蛋白表达水平的检测进一步证实了 TLR7的表达异常，提示 HIV-1 感染过程中 TLRs 的表达发生了变化。但 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞上 TLR7 的表达与 CD4+T 细胞计数、病毒载量均无明显相关性。根据 CD4 细胞计数（200cells/l 和200cells/l） 、病毒载量（105copies/ml 和105copies/ml）及有无接受 HAART 治疗对 HI

199、V-1 感染者进行分组，TLR7 的表达亦无显著差异。 2TLR7 配体 CL097（0.5、1 和 5g/ml）可刺激 HIV-1 感染者和正常人纯化 CD8+T 细胞表面 CD69 的表达，但 CD69 在 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞表面的表达显著高于其在正常人 CD8+T 细胞表面的表达。 且 CD69 的表达呈浓度依赖性，CL097 在 0.5g/ml 时其表达最高。CL097 同样可刺激 PBMC 中CD8+T 细胞表面 CD69 的表达， 但与纯化 CD8+T 细胞表面 CD69 的表达无明显差异，提示 TLR 信号与 HIV-1 感染过程中的免疫激活有一定关系，它能活化

200、 HIV-1 感染者 CD8+T 细胞，并且这种作用不依赖于辅助因子的参与。 3不同浓度的 CL097（0.5、1 和 5g/ml）孵育 6 小时或 20 小时后，均不能刺激 HIV-1 感染者纯化的 CD8+T 细胞产生 IL-2 和 IFN-。但 CL097 可刺激PBMC 中的 CD8+T 细胞产生 IFN-，且 IFN- 的产生呈时间和浓度依赖性，CL097 在 1g/ml 时 IFN- 的产生达到最大。提示 HIV-1 感染过程中 TLR7配体可刺激 CD8+T 细胞产生抗病毒分子，但需要辅助因子的参与。 76 参考文献参考文献参考文献参考文献 1. UNAIDS/WHO 2007

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299、肿瘤科攻读硕士。 2005 年继续在唐都医院传染科攻读博士学位。现工作单位为兰州军区临潼疗养院第二疗区。 博士期间论文发表情况： 1. Yang Song, Yan Zhuang, Song Zhai, Dedong Huang, Ying Zhang, Wenzhen Kang, Xinhong Li, Qigui Yu,Yongtao Sun .Increased Expression of TLR7 in CD8+ T cells Leads to TLR7-Mediated Activation and Accessory Cell-Dependent IFN-Production i

300、n HIV-1 Infection. Curr HIV Rev. under review. 2. Song Zhai,Yan Zhuang, Yang Song, Shu Li, Dedong Huang, Wenzhen Kang, Xinhong Li,Qi Liao,Yanhou Liu,Zhongfang Zhao,Yichen Lu, Bruce D. Walker, Marcus A .Altfeld,Xu G Yu and Yongtao Sun. HIV-1-Specific Cytotoxic T Lymphocyte (CTL) Responses against Imm

301、unodominant Optimal Epitopes Slow the Progression of AIDS in China.Curr HIV Rev. under review. 94 致致致致 谢谢谢谢 本研究的顺利进行是在导师孙永涛教授的悉心指导下完成的。三年来，导师不仅在课题选择、实验的完成和论文的撰写中投入了大量的精力，在生活中也给了我许许多多无私的帮助。导师渊博的知识、严谨的学术作风、忘我的工作精神、朴实无暇的为人，是我一生学习的楷模。他以高尚的道德情操教我懂得如何做人，使我终生受益，永远感激。在这里，让我将最深的敬意和谢意献给我尊敬的导师。 衷心感谢白雪帆主任、黄长形副主

302、任、聂青和副主任在试验中给予的关心、支持和无私的帮助。他们严谨求实的科研作风和精益求精的敬业精神，使我终身受益。 在整个课题研究过程中，康文臻副教授、李新红副教授自始至终奔波忙碌着，对实验的每一个细节都给予了悉心的指导。没有你们的谆谆教诲和鼎力支持就没有今天课题的顺利完成，在此致以衷心的谢意。 真诚感谢王平忠副教授、连建奇副教授、庄严博士、翟嵩博士、黄德东博士、姜泓博士、张颖博士、刘清泉博士、张野硕士、彭梅娟硕士、徐哲博士、孙利博士、魏欣博士以及传染科全体医护人员在实验期间给予的热情帮助和大力支持。 在此，谨向我的导师孙永涛教授和所有关心、帮助、支持我的老师、同学、朋友、家人致以崇高的敬意！