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1、2 细胞增殖和侵 e p t o rp o t e n t i a l c h a n n e lT R P C1o nt h ep r o l i f e r a t i o na n di n v a s i o no f h u m a nn a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m ac e l ll i n eC N E 2 课题来源：自选 专业名称肿瘤学 学位申请人何本夫 指导教师罗荣城教授 答辩委员会主席陈尊器教授 答辩委员会成员韩焕兴研究员 林丽珠教授 陈龙华教授 李金瀚教授 论文评阅人韩焕兴研究员 谢德荣教授 何建行教授 2 0 11
2、年3 月31 日广州 博士学位论文 瞬时受体电位通道T R P C I 在人鼻咽癌O N E 2 细胞 增殖和侵袭作用的初步研究 博士研究生：何本夫 指导教师：罗荣城教授 摘要 鼻咽癌属于E B 病毒引起的一种最常见的非淋巴细胞恶性肿瘤，全世界年 发病率平均为1 1 0 万，在东南亚，特别是我国南方的部分地区发病率达N l o o 1 0 万。目前，临床上治疗鼻咽癌的手段虽然比较多，包括放射治疗、化疗和分 子靶向治疗等，疗效也较好。由于鼻咽癌发生部位隐蔽、原发灶小、症状轻微，往 往不为患者察觉和重视。鼻咽癌的生物学特性及周围淋巴组织丰富，使较其他头 颈部肿瘤更具转移和浸润性，往往在出现临床症状
3、前已远处转移，约9 0 的患者 以颈部淋巴结肿大为首诊。局部的复发和远处转移是导致鼻咽癌治疗失败的原 因。因此，探讨鼻咽癌浸润和转移机制具有重要意义。 正常组织细胞在特殊情况下也具备迁移能力，如胚胎发育、免疫细胞、创 伤愈合。而肿瘤细胞由正常细胞在多种因素作用下经过演变，形成强于正常组 织细胞的转移和增殖能力。肿瘤细胞虽然具备自身特点，由于来源于正常组织 细胞，在很多方面还是原有功能的沿用或是增强。我们试图通过寻找在正常细 胞中证实已与细胞迁移增殖密切相关的因子，并对其机制进行研究。 瞬时受体电位通道( T I 心c h a n n e l s ) 是位于细胞膜上的一类重要的非选择性阳 离子通
4、道超家族。T R P 通道分为：T R P C 、T R P V 、T R P M 、T R P A 、T R P P 、T R P N 和T R P M L 7 X 亚家族。T R P 通道家族成员分布广泛，现已知，分布于中枢神经系统、 外周神经系统、皮肤、心血管系统、呼吸系统、胃肠道系统、泌尿生殖系统以 及免疫和内分泌系统等。 中文摘要 T R P C 的C 末端，以T I 冲框为起点，存在一个保守的2 5 个氨基酸序列区，叫T R P 结构域，有关T R P 结构域的功能目前还不清楚，R o h a e s 等研究提示，T R P 结构域 参与调节T R P 通道的功能。T R P C
5、( c a n o n i c a lT R P ) 亚家族包括T R P C I 7 ，共7 种亚 型。T R P C I 在脑、心脏、肾脏、肺、骨骼肌、前列腺、皮肤、睾丸和卵巢都检 测到其高水平表达。作为最早被发现的哺乳动物T R P 通道，T R P C I 公认的功能是 参与受体介导的、钙依赖的平滑肌及腺体的分泌和收缩功能，参与细胞膜受体 激活磷脂酶C ( P L C ) 后所介导的钙离子进入。T R P C I 通道为非选择性阳离子通道， 主要通过的离子为钙离子、钠离子。 T R P 通道可以作为细胞膜C a 2 + 通道调节细胞内C a 2 + 浓度，参与体内与C a 2 + 信
6、号相关的许多重要生理过程，如细胞的生长及细胞坏死、树突形成、细胞周期 的调节、细胞的迁移等。大量研究表明，细胞内钙离子与肿瘤关系密切，直接 参与调控肿瘤的生长、侵袭、转移和分化，从而导致肿瘤不可控制的扩散和侵 犯。Y a s s i n eE 1H i a n i 等报道，在M C F 7 细胞中，提高细胞内钙离子浓度可以引起 T R P C I 高表达和细胞增殖。V a l e r i eC 等证实T R P C I 通道介导恶性神经胶质瘤的迁 移。综合文献，我们认为瞬时受体电位通道家族之一的T R P C I 可能与肿瘤细胞 的迁移和增殖相关。 本研究利用基因沉默技术和T R P 通道特异
7、阻断剂初步研究T R P C I 基因在鼻 咽癌增殖、侵袭中的作用，探讨T R P C I 作为鼻咽癌癌分子靶点的可行性，为鼻 咽癌癌患者的诊断、预后评价、综合治疗方案设计提供有力的理论依据。 方法 1 、T R P C I 蛋白在人鼻咽癌组织和正常鼻咽组织的分布和表达研究 选取鼻咽癌病理切片3 0 例，鼻咽部正常组织切片2 0 例，用免疫组化( m C ) 方法检测T R P C I 蛋白在人鼻咽癌组织和正常鼻咽组织的分布和表达研究。 2 、T R P C I 基因在人鼻咽癌细胞中的表达研究 应用荧光定量P C R ( Q P C R ) 和免疫细胞化学方法检测C N E 2 、C 6 6
8、6 1 和 6 1 0 B3 株鼻咽癌细胞中T R P C I 基因的表达研究。根据目的基因T R P C I 及看家 基因I B - a c t i n 的扩增曲线，得到各自的C t 值，通过公式计算2 心值，在相对定 I I 博士学位论文 一9 9 7 7 8 3IY 1 量分析中，我们以2 - , , c t 表示与C N E 2 相比，6 1 0 B 和C 6 6 6 1 细胞株中T R P C I 基因的相对表达水平。采用单样本t 检验比较6 1 0 B 、C 6 6 6 1 细胞株和C N E 2 中 T R P C Im R N A 水平，独立样本t 检验比较的6 1 0 B 和
9、C 6 6 6 1 细胞株中T R P C I m R N A 水平。 3 、利用基因公司设计合成的3 条针对T R P C I 的s i R N A 片段及l 条阴性对照s i R N A 片段，然后分别将这4 条s i R N A 片段转染进入不同的C N E 2 细胞，荧光定量P C R ( Q P C R ) 检测T I 心C 1 基因干扰情况。挑选干扰效率最高的s i R N A 片段进行细胞 稳转，建立稳定细胞株。 4 、采用病毒感染法分别将空质粒和干扰质粒p S u p e r - r e t r o p u r o 转染进入不同的 C N E 2 细胞中，应用Q P C R 与
10、W e s t e r nB l o t 检测稳定细胞株的T R P C I 基因及蛋白表 达水平改变。 5 、Q P C R 检测基因沉默后T R P C I 、M M P 2 和M M P 9 的变化 根据目的基因T R P C I 及看家基因B a c t i n 的扩增曲线，得到各自的C t 值，通 过公式计算2 - A A C 值，在相对定量分析中，以2 - c 表示与未转染的C N E 2 相比， 干扰( C N E 2 一s i T R P C I ) 和空载( C N E 2 v e t o r ) 转染后的C N E 2 细胞株中T R P C I 、 M M P 2 和M
11、M P 9 基因的相对表达水平。采用单样本t 检验比较C N E 2 s i T R P C I 、 C N E 2 v e t o r 与C N E 2 细胞的T R P C I 、M M P 2 和M M P 9m R N A 水平，独立样本t 检验 比较C N E 2 s i T R P C I 和C N E 2 v e t o r 细胞中T R P C I 、M M P 2 和M M P 9 m R N A 水平。 6 、T R P C I 基因表达沉默对鼻咽癌细胞生物学特性的影响 ( 1 ) 利用体外侵袭小室进行体外侵袭实验，检测T R P C I 基因沉默后对鼻咽癌侵袭 能力的影响
12、； ( 2 ) 利用M T T 法及流式细胞术检测n 冲C l 基因沉默后对细胞体外增殖的影响。 7 、T R P C I 阻断剂对鼻咽癌细胞生物学特性的影响 使用T R P 通道阻断剂2 A P B 作用于C N E 2 细胞后，应用Q P C R 与W e s t e r nB l o t 检测T I 冲C 1 基因及蛋白表达水平改变，同时Q P C R 检测M M P 2 和M M P 9 的变化影 响。利用M T T 法及流式细胞术检测T I 强C l 基因对细胞体外增殖和细胞周期的影 响；利用体外侵袭小室进行体外迁移和侵袭实验，检测T I 冲C 1 基因对鼻咽癌迁 I I I 鑫 中
13、文摘要 移和侵袭能力的影响。 结果 1 、T R P C I 蛋白在人鼻咽癌组织和正常鼻咽组织的分布和表达研究 免疫组化检测结果显示：鼻咽癌组织高表达，正常组织低表达T R P C I 蛋白 在3 0 例鼻咽癌组织中的总的阳性表达率为9 0 ( 2 7 3 0 ) ，高表达率为8 0 ( 2 4 3 0 ) 。 鼻咽癌组织T R P C I 蛋白表达率( 9 0 ) 显著高于鼻咽正常组织( 5 O ) ( 2 2 - - 2 2 0 0 5 ，P = 0 0 0 0 0 0 5 ) 。鼻咽癌组织T R P C I 蛋白表达强度显著高于正常 组织( Z 芦5 2 7 4 ，P = 0 0 0 0
14、 0 0 5 ) 。 2 、T R P C I 基因在人鼻咽癌细胞中的表达研究 采用Q P C R 法检测三种鼻咽癌细胞株的T R P C I 基因表达情况。结果表明： 与C N E 2 ( 2 - A A C t = I ) 相比，6 1 0 B ( 2 出c L0 5 5 2 - j ：0 0 3 7 ) 和C 6 6 6 1 ( 2 。蛐= 0 7 3 6 - a ：0 0 9 5 ) 的T R P C Im R N A 水平均较低( f = - 2 0 9 1 8 ，- 4 7 5 7 ，P = O 0 0 2 ，0 0 4 1 ) ，说明C N E 2 细胞中的T R P C Im
15、R N A 表达水平高。免疫细胞化学检测结果显示，T R P C I 蛋白 在鼻咽癌细胞株中胞浆中阳性表达。 3 、利用Q P C R 技术筛选出于扰效率最高的s i R N A l ( 8 0 ) 为下一步实验的研 究对象( 命名为C N E 2 s i T R P C I 细胞) 。 4 、采用磷酸钙转染法将干扰效率最高的p S u p e r - r e t r o - p u r o - s i T R P C I 和 p S u p e r - r e t r o p u r o 质粒分别与P I K 包装质粒共转2 9 3 F T 包装细胞，经4 8 小时后收集 病毒上清感染鼻咽癌
16、细胞C N E 2 ，经嘌呤霉素( p u r oO 5l ag m 1 ) D M E M 选择培养 基中生长，筛选出沉默表达T R P C I 基因细胞和对照细胞分别命名为 C N E 2 s i T R P C1 ，C N E 2 一v e t o r 5 、荧光定量P C R 和W B 结果显示：C N E 2 s i T R P C I ( 2 峨O 1 4 9 - a = 0 0 3 1 ) 与作为 对照的细胞C N E 2 ( 2 AAC t = 1 ) 和C N E 2 v e t o r ( 2 AC t = O 8 8 4 0 1 2 4 ) 相比， T R P C Im R N A 水平有显著下调( t - - - 4 8 1 2 5 ，P = 0 0 0 0 ；f = 9 9 7 9 ，P 0 0 0 1 ) 。W e s t e r n b l o t 结果分别
