《猪骨髓间充质干细胞分离培养及其核移植胚胎发育潜能研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《猪骨髓间充质干细胞分离培养及其核移植胚胎发育潜能研究（57页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、东北农业大学 硕士学位论文 猪骨髓间充质干细胞分离培养及其核移植胚胎发育潜能研究 姓名：王振坤 申请学位级别：硕士 专业：发育生物学 指导教师：刘忠华 20080620 摘要 摘要 本实验以不同的方法分离培养了猪骨髓间充质干细胞( p M S C s ) ，对分离培养的p M S C s 生 物学特性进行了分析，并以p M S C s 为供核细胞进行了核移植实验，通过重构胚的体外发育能力 研究T p M S C s 的发育潜能：以人骨髓间充质干细胞( h M S C s ) 与猪卵母细胞构建了人猪异种重 构胚，研究了h M S C s 异种重构胚的体外发育能力，同时还对比研究了两种重构胚在激活
2、后的核 形态变化。实验取得以下结果： 1 以1 m g m l 胶原酶消化法分离培养P F s ，和胰蛋白酶消化法相比，可更为有效地解离细胞， 一般3 - - 4 d 即可达7 0 - 8 0 细胞汇合，因此可在较短的时间内成功地获取原代P F s 。 2 本实验采用密度为1 0 7 7 9 m l 的淋巴细胞分层液进行密度梯度离心分离p M S C s ，在同等 时间内，相对于全骨髓贴壁筛选法，该方法所获得的贴壁细胞量多，p M S C s 相对较纯。 3 本实验从形态学及细胞表面分子标记( V i m e n t i o n 和C D l 0 6 标记呈阳性，而C D 4 5 标记呈 阴性
3、) 来鉴定p M S C s ，初步确定所培养细胞为骨髓M S C s 。本实验体外培养的p M S C s 增殖倍增 时间( T d ) 为3 6 4 8 h ，分裂指数第4 d 达到峰值为2 3 6 + 4 7 ，1 0 h 的贴壁率为7 8 4 9 4 - 6 2 。 4 本实验选用了盲吸法对M I I 期的猪卵母细胞进行去核，去核率为8 6 O 士o 4 3 。 5 P F s 与p M S C s 重构胚的卵裂率( 7 6 0 4 士8 1 V S7 4 4 5 士1 2 1 ) 和囊胚率( 1 5 0 7 4 - 2 2 V S 1 4 6 3 4 - 7 9 ) 无显著差异，p
4、M S C s 重构胚囊胚内细胞数略高于P F s 重构胚与P A 胚胎( p O 0 5 ) 。 6 以h M S C s 和p M S C s 为供体细胞与猪M I I 期去核卵母细胞进行核移植得到重构胚，并进行 胚胎发育能力的比较，在7 2 h 之前，两者发育能力没有显著差异：但是在第7 d 时，h M S C s 异种 重构胚的囊胚率( 3 2 士o 7 ) 显著低于p M S C s 重构胚( 1 1 5 9 4 - 2 3 7 ) ( p 0 0 5 ) ；在激活后6 h ，有5 5 2 6 4 - 8 3 的h M S C s 猪异种重构胚形成原核，p M S C s 重构胚则为
5、5 8 18 4 - 7 8 ( p O 0 5 ) 。 8 在胚胎发育第5 d 分别计数了h M S C s 猪异种重构胚各发育阶段的胚胎数。停滞在4 细胞期的h M S C s 猪异种重构胚占2 8 8 0 士3 9 ，而p M S C s 重构胚及孤雌胚胎只有1 3 0 4 4 - 1 1 和1 4 0 6 4 - 1 5 ( p 0 0 5 ) 6 P M S C sa n dh M S C sa sd o n o rc e l l sw e r et r a n s f e r e di n t op o r c i n eM I Ie n u c l e a t eo o c y
6、t e st o p r o d u c er e c o n s t r u c t e de m b r y o s ，a n dt h ed e v e l o p m e n tc a p a b i l i t yo ft w ot y p e so fr e c o n s t r u c t e d e m b r y o sw a sw i t h o u ts i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e f o r e7 2 h ；b u tt h eb l a s t o c y s tr a t eo fh M S C s p o
7、r c i n e i n t e r s p e c i e s r e c o n s t i t u t e de m b r y o sW a so n l y3 2 - - 1 ：0 7 ，a n dt h eb l a s t o c y s tr a t eo fp M S C s r e c o n s t i t u t e de m b r y o sW a s11 5 9 士2 3 5 ( p O 0 5 ) I na d d i t i o n ，t h e r ew e r en os i g n i f i c a n t I I I d i f f e r e n
8、 c e si nt h ef o r m a t i o no fp r o n u c l e u sb e t w e e nt w ot y p e so f e m b r y 0 5a t6 ha f t e 。a c t l V a t l o r L 8 T h en u m b e r So fh M S C si n t e r s p e c i e sr e c o n s t i t u t e de m b r y o s a td i f f e rs t a g ew e r ec o u n t e dl n 5 d T h ep e r c e n t a
9、g e o fh M S C si n t e r s p e c i e s r e c o n s t i t u t e d e m b r y 0 t 4 吒创1 5 7w 冀 2 8 8 0 士3 9 磊，b u tt h e r ew e r eo n l y 1 3 0 4 + 1 1 a n d1 4 0 6 + 1 5 i ne m b r y o so fP M s c 3 a sd o n o ra n d P Ae m b r v o s ( p 0 0 5 ；标注不同表示差异显著，如：p 0 0 5 ；w h i l ed i f f e r e n tf i g u
10、 r e sm e a n s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ，毛b ：P o0 5 ) ；n 檄活后6 h 有5 52 6 83 的h M S C s - 猪异种重构 胚形成类原棱p M S C s 重构胚则为5 8 18 78 ( p O0 5 ) ( 袁3 _ 4 蚓3 - 1 6 ) 。重构胚染色体 凝集的形态与原棱形志见圈3 - 1 7 。 C “k 影 ：=一k黟 表3 4 两种供枝圭丑 胞核移植激活后2 h 和6 h 核形态的比较 T a b3 * 4 N u c l e a r S t r u c t u r eo f N T E
11、 m b r y o s2a n d6h r A f t e r A c t i v a t i o n 注：同一列中标注相同表示差异不显著，p ) 0 0 5 ；标注币同表示差异显著一b ，c ：p 0 0 5w h i l ed i f f e r e n t ：f i g u r e s m e a l s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ，a , b ，c ：P 00 5 ，标注不同表示差异显并，曲c ：p 0O S w h i l ed i f f e r e n t ：f i g u m s m e a n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e ，a , b 。c ：P O 0 5 ) ；在6 h 时，p M S C s 重构胚形成原核的胚胎百分数为5 8 1 8 ，而同期h M S C s 重构 胚胚胎数为5 5 2 6
