湖南大学 硕士学位论文 拟南芥CIPK1基因功能的初步研究 姓名：刘实 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：刘选明;林辰涛 20070510 硕士学位论文 II 摘 要 在拟南芥中存在一类钙调素 B 蛋白家族(calcineurin B-like proteins,CBL)，它 的 靶 蛋 白 是 一 类 具 有 丝 氨 酸 / 苏 氨 酸 激 酶 活 性 的 蛋 白 ， 被 称 为CIPK (CBL-interacting protein kinase)最近的研究表明，CBLs 与 CIPKs 家族可能在植 物对逆境应答的信号转导过程中起重要作用，但 CIPK1 基因在胁迫信号中的反应 还未见报道本研究从拟南芥中克隆 CIPK1 基因，并筛选其突变体，首次探讨了 CIPK1 在 ABA（脱落酸）控制种子萌发信号途径中的作用，论文的具体研究结果 如下： 以持家基因 β-actin 作为内参， 利用 RT-PCR （逆转录 PCR） 检测拟南芥 CIPK1 基因在拟南芥不同器官中的表达，以及不同激素对此基因表达的调节结果表明： CIPK1 基因在拟南芥的根、茎、叶、花和果荚中均有表达，其中在茎和花中表达 量最高，在叶中表达量最低；ABA 处理 1h，CIPK1 基因的表达量达到最高峰； GA 处理初期则抑制该基因的表达， 处理 2h 后表达量逐渐恢复到未处理时的水平； 2,4-D 和 6-BA 处理也可使该基因表达量微弱增加；由此可以推断 CIPK1 基因的 表达具有组织特异性，并且主要与 ABA 密切相关，与其它激素关系不大。
为了更好的理解 CIPK1 基因在 ABA 信号传导中的作用， 我们首先用 Gateway 的方法对 CIPK1 基因进行克隆，然后转化到野生型中，用 Basta 筛选 3 代后，得 到了该基因表达量明显下降的共抑制转基因 cipk1 突变体；对 ABA 处理下野生型 和突变体的萌发率进行测量，发现该突变体种子对 ABA 的敏感性下降，用 0.2M 和 0.4mol/L ABA 处理 5 天后，突变体种子的萌发率为 76%和 43%，而野生型为 47%和 10%在 ABA 胁迫下 cipk1 突变体种子的萌发率明显高于野生型，表明 CIPK1 在 ABA 促进种子休眠的信号传导途径中起非常重要的作用 综上所述，ABA 能诱导 CIPK1 基因的表达，并且可能通过 CIPK1 基因来调 控种子休眠这为进一步揭示 ABA 的信号传递途径和育种工作提供理论依据 关键词：拟南芥；CIPK1；基因表达；RT-PCR；种子萌发 拟南芥 CIPK1 基因功能的初步研究 III Abstract A new type of Ca2+ sensors unique to Arabidopsis have been studied recently, they are the so-called CBLs for their similarity to B-subunit of yeast and animal calcineurin. Plant CBLs interact with and regulate the activity of a group of Ser/Thr protein kinases, referred to as CIPKs. The analysis of CBLs and CIPKs families revealed that they play an important role in the stress signal transduction pathway of higher plants. But there is no report about CIPK1 genefunction in the signal pathway of stress. So, in this research, we cloned CIPK1 gene form Arabidopsis and screened mutants, so as to research the role of CIPK1 gene in the signal pathway of ABA seed dormancy regulation.The results of this study were listed as follows: RT-PCR was used for the analysis of the expression level of CIPK1 gene, and it was found that CIPK1 gene was constitutively expressed in Arabidopsis roots, stems, leaves, flowers and siliques. In stems and flowers it was mostly expressed, and least in leaves. The expression of CIPK1 gene increased to the maximum with ABA for 1h, and decreased with GA, However, it restored to the original with GA after 2h in Arabidopsis. The expression of CIPK1 gene was up-regulated slightly by 6-BA and 2,4-D. These results indicated that the expression CIPK1 gene was involved in response to ABA stress. To better understand the role of CIPKl gene in stress-responsive pathway, we firstly cloned the CIPKl gene using Gateway technology, then we transform it to wild type (WT). By screening the transgenic mutants with baster, several co-suppression mutants were obtained. After being treated with ABA, differences in physiology between Arabidopsis cipk1 mutant and wild type (WT) were analyzed. Treated with 0.2M and 0.4M ABA for 5d, the germination frequency of cipk1 mutant was 76% and 43%, and the germination frequency of WT was 47% and 10%. All the results showed that the germination frequency of cipk1 mutant was higher than that of WT under ABA stress and the CIPK1 gene plays an important role in regulating seed dormancy to ABA signal. Taken together, our data provide evidence that CIPK1 gene encodes a receptor like kinase essential in regulating seed dormancy to ABA signal. These results certainly helped to do further studies on establishing ABA-independent signal transduction in plants and provide academic base to breeding work. 硕士学位论文 IV Key words: Arabidopsis; CIPK1; Gene expression; RT-PCR; Seed germination 拟南芥 CIPK1 基因功能的初步研究 VII 插图索引 图 1.1 ABA 生物合成间接途径……………………………………………………3 图 1.2 ABA 调控种子萌发……………………………………………………………11 图 2.1 拟南芥不同器官提取的 RNA………………………………………………16 图 2.2 CIPK1 基因在拟南芥各器官中的表达………………………………………16 图 2.3 ABA 处理（0、0.5、1、3、6h）后，提取幼苗的 RNA…………………………17 图 2.4 ABA 处理不同时间诱导 CIPK1 基因表达的变化……………………………17 图 2.5 GA 处理(0、 0.5、 1、 2、 4、 6h)后提取幼苗的 RNA………………………………17 图 2.6 GA 处理不同时间诱导 CIPK1 基因表达的变化………………………………18 图 2.7 2,4-D 处理(0、 1、 2、 4、 8、 12h)后提取幼苗的 RNA……………………………18 图 2.8 2,4-D 处理不同时间诱导 CIPK1 基因表达的变化…………………………19 图 2.9 6-BA 处理(0、 1、 2、 4、 8、 12h)后提取幼苗的 RNA………………………………19 图 2.10 6-BA 处理不同时间诱导 CIPK1 基因表达的变化…………………………20 图3.1 Gateway技术总结……………………………………………………………21 图 3.2 CIPK1 基因的 PCR 扩增以及产物回收………………………………………25 图 3.3 BP 反应…………………………………………………………………………26 图 3.4 LR 反应…………………………………………………………………………26 图 3.5 LR 反应产物转入农杆菌………………………………………………………27 图 4.1 用 Basta 筛选转基因植物………………………………………………………30 图4.2 提取野生型（WT）和突变体（cipk1）总RNA………………………………31 图 4.4 ABA 对突变体 （cipk1） 和野生型 （WT） 萌发率的影响………………………32 图 4.5 用 0、0.2、0.4、0.6mol/L ABA 处理 5d 后，转基因拟南芥（cipk1）和野 生拟南芥(WT)种子的萌发率…………………………………………………………32 硕士学位论文 VIII 缩 略 词 WT 野生型 wild-type CDPKs 钙依赖性蛋白激酶 calcium-dependent protein kinases CBL 钙调素 B 蛋白家族 calcineurin B-like CIPK CBL 互作蛋白激酶 CBL-interacting protein kinase AMPK AMP 激活的蛋白激酶 AMP-activated protein kinase SnRK SNF1 相关蛋白激酶 SNF1-related protein kinase ABRE。