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1、河北工业大学 硕士学位论文 溶血磷脂酰胆碱和磷脂酶A诱导溶酶体失稳的机制研究 姓名：胡金山 申请学位级别：硕士 专业：生物物理学 指导教师：赵同军 20070601 河北工业大学硕士学位论文 i 溶血磷脂酰胆碱和磷脂酶溶血磷脂酰胆碱和磷脂酶 A2诱导溶酶体诱导溶酶体 失稳的机制研究失稳的机制研究 摘摘 要要 溶酶体作为细胞内唯一的酸性细胞器在细胞生命活动中起到重要作用，执行着更新细 胞内的生物大分子，消化细胞所吞噬的异物以及加工营养物质等生理功能。正常生理状态 下，溶酶体具有良好的完整性和稳定性，一旦溶酶体完整性遭到破坏不仅会造成细胞自身 生理功能的紊乱，还具有一定的细胞毒性，可能引起细胞凋亡
2、或者坏死。以往研究焦点主 要集中在溶酶体失稳后的细胞效应，但对导致溶酶体完整性丧失的病生理因素和机制却知 之甚少。 最近有研究表明， 在一些细胞病变中溶血磷脂酰胆碱和磷脂酶A2水平显著品增高， 是否这些生物活性物质会对溶酶体的膜的结构造成损伤尚不清楚。 本论文的工作证实了溶血磷脂酰胆碱和磷脂酶A2能够诱导溶酶体失稳，并阐明了他们 导致溶酶体失稳的机制。通过测量溶酶体标志酶的自由酶活、膜电位、质子漏、溶酶体内 部pH以及他们在低渗蔗糖中的潜伏性丧失情况，我们主要得出了以下结论：溶血磷脂酰胆 碱和磷脂酶A2处理增大了溶酶体膜的钾离子通透性和质子通透性，溶酶体膜的上述变化促 进了钾离子经过K+/H+
3、机制进入溶酶体。另外，lysoPC和PLA2处理增大了溶酶体的渗透敏感 性。跨膜渗透压的不平衡引起溶酶体渗透失稳，是导致溶酶体丧失完整性的关键因素。 关键词关键词:溶酶体，溶血磷脂酰胆碱，磷脂酶 A2，钾离子通透性，质子通透性，渗透敏感性 溶血磷脂酰胆碱和磷脂酶 A2诱导溶酶体失稳的机制研究 ii MECHANISM OF LYSOPHOSPHATIDYLCHOLINE AND PHOSPHOLIPASE A2 INDUCED LYSOSOME DESTABILIZATION ABSTRACT Lysosomal disintegration can cause losses of its p
4、hysiological functions and cytotoxic effects on living cells. As reported previously, some environmental factors can affect lysosomal stability. However, the physiological factors and mechanisms of the event remain to be elucidated. A series of studies testified that cytosolic lysoPC and PLA2 were e
5、nhanced in certain cellular pathological changes. Whether they can influence lysosomal membrane lipids and destabilize lysosomes is still unclear. In this study, we established that lysoPC and PLA2 can injure lysosomes and elucidated the related mechanisms of lysosomal destabilization. By measuring
6、the free activity of lysosomal -hexosaminidase, their membrane potential, proton leakage, intra-lysosomal pH and their enzyme latency loss in hypotonic sucrose medium. We demonstrated that lysoPC and PLA2 could increase the lysosomal permeability to both potassium ions and protons, and enhance the l
7、ysosomal osmotic sensitivity. These changes in the lysosomal membrane properties promoted influx of potassium ions into the lysosomes via K+/H+ exchange. The resulted osmotic imbalance across the membranes osmotically destabilizes the lysosomes and led to losses of the lysosomal integrity. KEY WORDS
8、：lysosome, lysophosphatidylcholine, phospholipase A2, potassium permeability, proton permeability, Osmotic sensitivity 河北工业大学硕士学位论文 - 1 - 第一章第一章 绪绪 论论 溶酶体（lysosome）源自希腊语“lys”和“soma”， 为“消化小体”之意。其命名者 Christian de Duve 于上世 纪五十年代（如图 1.1），在对肝细胞中参与糖代谢的细 胞器的研究中偶然发现，经差速离心获得的富含酸性磷酸 酶区段经过自然放置几天后酶活性显著增强。经过不断探
9、索，发现该酶主要位于膜包裹的结构中，并排除了线粒体 和微粒体的可能，至 1955 年又在该离心区段中发现 4 种 酸性水解酶。随着离心分离技术和电镜技术的发展，溶酶 体的分离纯化成为可能，并被直接观察，其存在最终被学 术界认可。 de Duve 因此于 1974 年分享了诺贝尔生理医学 奖。 在溶酶体发现五十周年之际， 他在国际权威杂志Nature Cell Biology 上回顾了这一重大科学发现1。 经过半个世纪对溶酶体的深入研究，发现溶酶体几乎 存在于所有的动物细胞，植物细胞中的液泡和圆球体也可 被认为是一种溶酶体，就连原生动物细胞中也存在类似溶 酶体的结构，只有原核生物中没有溶酶体。典
10、型的细胞中 含有约数百个溶酶体，直径介于几百纳米至几个微米之 间，不同的细胞中溶酶体的数量和形态有很大差异，在一 些代谢旺盛（如大鼠肝细胞）或者具有吞噬作用（如巨噬 细胞）的细胞中，溶酶体含量尤其丰富。即使在同一类型 细胞中，溶酶体的大小、形态也不尽相同。溶酶体是典型 的异质性细胞器（如图 1.2） ，这主要是由于细胞中每个溶 酶体处于不同生理功能阶段的缘故。采用差速离心和密度 梯度离心方法可以从组织或者细胞中分离出纯度较高的 溶酶体，通过酸性磷酸酶的组织化学染色可以对溶酶体进 行传统的光镜和电镜等形态学观察，利用免疫亲和抗体或 者荧光染料还可以对溶酶体进行原位观察。随着生物学与 其他各学科的
11、交叉发展，为生命问题的解决积累了丰富的 技术手段，我们有理由相信在不久的将来，溶酶体相关问 题的解决必将对生命科学的发展起到深远的推动作用。 图 1.1 溶酶体发现者 迪乌夫 Fig. 1.1 Christian de Duve 图 1.2 细胞中的溶酶体 Fig. 1.2 Lysosomes in cell 溶血磷脂酰胆碱和磷脂酶 A2诱导溶酶体失稳的机制研究 - 2 - 1-1 溶酶体的结构与功能 1-1 溶酶体的结构与功能 溶酶体为单层膜包围、内含多种酸性水解酶类的囊泡状细胞器，其脂双层约为 7.5nm 厚。溶酶体 膜成份与质膜成份接近，而与其他细胞器膜组成不同2（如表 1.1） ，这可
12、能是由于质膜与溶酶体膜融和 的结果。溶酶体膜上嵌有 V 型 H+-ATPase，该酶借助水解 ATP 释放能量将 H+转运到溶酶体内部，使溶 酶体内部的 H+浓度比细胞质中高 100 倍以上，形成和维持了稳定的酸性环境。溶酶体内部 pH 比细胞 质中的 pH 低大约 2 个单位，该酸性环境不仅有利于维持溶酶体内部水解酶的活性，还有利于催化酶的 水解过程。碱性物质氢氧化氨、氯喹、氨等均可以升高溶酶体内部的 pH, 抑制溶酶体内部水解酶对蛋 白质的降解反应3。此外，维持溶酶体内部低 pH 也是多种生物大分子跨膜转运的必要因素之一。Jonas 研究发现，溶酶体膜上存在多种载体蛋白用于向外转运水解产物
13、，这些载体蛋白大多对跨膜 pH 梯度敏 感4。质子漏出，溶酶体的跨膜质子梯度改变，会直接影响到溶酶体膜两侧其他离子的通透平衡，从而 影响溶酶体的渗透稳定性。Nilsson 等发现 TNF 诱导的 U937 细胞发生凋亡时，溶酶体内部质子外流引 起细胞内 pH 下降5。此外，V 型 H+-ATPase 抑制剂 bafilomycin A1 和 concanamycin A1 均可引起细胞凋 亡6，而 F 型 H+-ATPase 抑制剂寡霉素（oligomycin）却无此作用7。 溶酶体内含有蛋白酶、核酸酶、酯酶、磷脂酶、磷酸酶和硫酸酶等 60 余种水解酶，其共同的特征 都属于酸性水解酶，即这些酶
14、的最适 pH 在 5 左右。上述酶中大多是糖蛋白，可溶性的酶大多以阴离子 复合物形式存在， 而结合性的酶大多以水溶性多聚阳离子复合物的形式结合到带负电溶酶体内膜上。 溶 酶体膜蛋白高度糖基化，在溶酶体内部低 pH 的环境下，其水解酶并不直接水解膜上的脂类分子8，但 酸性鞘磷脂酶除外，它可以缓慢水解膜上的鞘磷脂9。 表 1.1 鼠肝细胞膜的磷脂组成2 Table1 1.1 Phospholipid composition of rat liver cell membrane NOTE: all values are expressed as M percent of total phosphol
15、ipids. PC: phosphatidylcholine, PE: phosphatidylethanolamine, SM: sphingomyelin, PI: phosphatidylinositol, PS: phosphatidylserine, PG: phosphatidylglycerol, DPG: diphosphatidylglycerol, PA: phasphatide acid, LPC: lysophosphatidylcholine, LPE: lysophosphatidylethanolamine, nd: not detectable. PC PE SM PIPSPG DPG PALPC LPE Mitochondrion 40.9 33.4 2.4 6.50.92.3 15.8 1 1.4 nd lysosome 37.7 19.2 32.97.4 (total)nd 6.8 (total) 0 nd Golgi 45.6 17.8 12.58.64.2nd nd nd 5.9 6.3 Cell Membrane 37.1 18.6 18.17.06.24.8 traces4.41.9 nd
