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1、河北医科大学 硕士学位论文 头孢曲松钠通过调制胶质细胞谷氨酸转运体-1发挥抗全脑缺血 性脑损伤作用 姓名：徐静 申请学位级别：硕士 专业：病理学与病理生理学 指导教师：李文斌 20090301 中文摘要 头孢曲松钠通过调制胶质细胞谷氨酸转运体一1 发挥抗全脑缺血性脑损伤作用 摘要 目的：谷氨酸是中枢神经系统重要的神经递质，也是细 胞通讯传递、生长、分化和可塑性的重要调质。然而，谷氨 酸的过度蓄积会引起神经元的死亡。兴奋性谷氨酸转运体是 调节谷氨酸浓度的主要途径，其中星形胶质细胞谷氨酸转运 体1 ( g l u t a m a t et r a n s p o r t e r - 1 ，G L
2、T - 1 ) 在终止谷氨酸能神经传 递，维持细胞外液谷氨酸浓度处于正常水平方面发挥重要作 用。 2 0 0 5 年R o t h s t e i n 等报道，p 内酰胺类抗生素头孢曲松 钠( C e f l r i a x o n e ，C e f ) 可以特异性地增强G L T - 1 的表达和对 谷氨酸的摄取。随后，韩国学者C h u 于2 0 0 7 年报道C e f 能 通过上调G L T - 1 的表达缩小大脑中动脉闭塞性脑梗塞的梗死 灶范围。最近研究发现：在大脑中动脉闭塞性脑缺血动物模 型中，C e f 可以明显降低动物的死亡率、改善神经功能、提 高存活率。我室研究发现，在大鼠全
3、脑缺血耐受模型中，预 防性给予G L T - 1 的特异性激动剂C e f 可上调大鼠海马C A I 区G L T - 1 蛋白的表达，并且减轻全脑缺血引起的海马C A l 区锥体神经元迟发性死亡( d e l a y e dn e u r o n a ld e a t h ，D N D ) 。 但是在全脑缺血模型中，C e f 是否是通过上调G L T - 1 蛋白的 表达和功能来发挥抗脑缺血作用尚有待于进一步证实。 因此，本实验应用大鼠四血管闭塞全脑缺血整体动物模 型，观察G L T - 1 的反义寡核苷酸( a n t i s e n s eo l i g o d e o x y - 中
4、文摘要 n u c l e o t i d e s ，A S O D N s ) 对C e f 诱导的G L T - 1 表达上调和功 能改变、以及脑缺血耐受的影响，进一步证实C e f 通过上调 G L T - 1 蛋白表达和功能发挥抗全脑缺血性脑损伤作用，为临 床上脑血管疾病的防治研究提供新的线索和依据。 lG L T - 1A S O D N s 抑制C e f 诱导的G L T - 1 表达上调和脑缺血 耐受 1 1G L T - 1A S O D N s 对C e f 引起的大鼠海马C A l 区G L T - 1 蛋 白表达上调的影响 动物分组及方法：将1 2 0 只凝闭双侧椎动脉
5、的雄性 W i s t a r 大鼠( 2 7 0 3 2 0g ) 随机分为以下两部分共6 组： 1 1 1G L T - 1A S O D N s 对C e f 引起的s h a m 大鼠海马C A l 区 G L T - 1 蛋白表达上调的影响 ( 1 ) s h a m 组( n = 1 0 ) ：行全脑缺血的s h a m 手术，即只 暴露但不夹闭双侧颈总动脉，于s h a m 手术后1 2h ( n _ 5 ) 和 2 4h ( n _ 5 ) 取海马C A l 区观察G L T - 1 表达的变化。 ( 2 ) C e f + s h a m 组( n = 1 0 ) ：腹腔注射
6、C e f ( 2 0 0m g k g ) ， 每日一次，共5 次；末次C e f 注射后1d 行全脑缺血的s h a m 手术；其它同s h a m 组。 ( 3 ) A S O D N s + C e f + s h a m 组( n = 4 0 ) ：在C e f + s h a m 组的 基础上，于第一次注射C e f 后3 6h 、7 2h 以及s h a m 手术前 1 2h 右侧脑室注射G L T - 1A S O D N s 双蒸水溶液l O 山，设9 n m o l 和1 8n m o l 两个剂量组；其它同s h a m 组。同时设双蒸 水( A S O D N s 溶剂
7、) 对照组( n _ 1 0 ) 和无意义寡核苷酸( r a n d o m o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s ，R - O D N s ，1 8n m 0 1 ) 对照组( n = 10 ) 。 1 1 2G L T - 1A S O D N s 对C e f 引起的全脑缺血大鼠海马C A l 区G L T _ 1 蛋白表达上调的影响 中文摘要 在上述s h a m 组的基础上，增加以下3 组： ( 4 ) 全脑缺血组( n _ 1 0 ) ：全脑缺血8m i n 后恢复血液再 灌流；于全脑缺血后1 2h ( n = 5 ) 和2 4h (
8、n - - 5 ) 取海马C A l 区观察G L T - l 表达变化。 ( 5 ) C e f + 全脑缺血组( n = l O ) ：腹腔注射C e f , 每天一次， 共5 次；末次C e f 注射后1d 行全脑缺血8m i n ；其它同全脑 缺血组。 ( 6 ) A S O D N s + C e f + 全脑缺血组( n = 4 0 ) ：在C e f + 全脑 缺血组的基础上，于第一次注射C e f 后3 6h 、7 2h 以及全脑 缺血手术前1 2h 右侧脑室注射G L T - 1A S O D N s 双蒸水溶液 1 0 斗l ，设9n m o l ( n = 5 ) 和1
9、8n m o l ( n 5 ) 两个剂量组；其 它同全脑缺血组。同时设双蒸水( A S O D N s 溶剂) 对照组 ( n = 1 0 ) 和R O D N s ( 1 8n m 0 1 ) 对照组( n = 1 0 ) 。 以上各组均以W e s t e r n 免疫印迹分析法检测大鼠海马 C A l 区G L T - 1 的表达，以G L T - 1 与1 3 - a c t i n 免疫条带的积分 光密度( i n t e g r a lo p t i c a ld e n s i t y , I O D ) 比值表达G L T - 1 的相 对表达量，比值越大，表达越多。 结果：
10、S h a m 组大鼠可见海马C A l 区G L T - 1 蛋白的基础 表达。与s h a m 组相比，C e f + s h a m 组G L T - 1 表达明显上调 ( P 0 0 5 ) 。与C e f + s h a m 组相比，A S O D N s ( 1 8n m 0 1 ) + C e f + s h a m 组G L T - 1 的表达明显降低( P O 0 5 ) 。 与s h a m 组相比，全脑缺血打击后G L T - 1 的表达无明显 变化。与全脑缺血组相比，C e f + 全脑缺血组G L T o l 的表达明 显上调( 尸 O 0 5 ) 。与C e f +
11、 全脑缺血组相比，A S O D N s ( 1 8 中文摘要 n m 0 1 ) + C e f + 全脑缺血组G L T - 1 的表达明显降低( 尸 O 0 5 ) ， 而双蒸水对照组、A S O D N s9n m o l 组和R O D N s ( 18n m 0 1 ) 对照组G L T - 1 的表达无显著变化。 上述结果表明，C e f 可上调s h a m 和全脑缺血大鼠海马 C A l 区G L T - 1 的表达，而预先给予G L T - IA s O D N s 可有效 抑制C e f 引起的G L T - 1 表达的上调。 1 2G L T - 1A S O D N
12、s 抑制C e f 抗全脑缺血引起的海马C A l 区 锥体神经元D N D 的作用 动物分组及方法：将4 0 只凝闭双侧椎动脉的雄性 W i s t a r 大鼠( 2 7 0 3 2 0g ) 随机分为6 组： ( 1 ) s h a m 组( n _ 5 ) ：行全脑缺血的s h a m 手术，于s h a m 手术后7d 取材观察海马C A l 区锥体神经元D N D 情况。 ( 2 ) C e f 对照组( n = 5 ) ：腹腔注射C e f ( 2 0 0m g k g ) ，每 日一次，共5 次；末次C e f 注射后ld 行全脑缺血的s h a m 手 术；其它同s h a
13、m 组。 ( 3 ) A S O D N s 对照组( n = 5 ) ：于s h a m 手术前3 5d ，2d 以及1 2h 右侧脑室注射G L T - 1A S O D N s ( 1 8n m 0 1 ) 双蒸水溶 液1 0 “l ，共注射3 次；上述时间点与A S O D N s + C e f + 全脑缺 血组注射A S O D N s 的时间点相对应。其它同s h a m 组。 ( 4 ) 全脑缺血组( n = 5 ) ：全脑缺血8m i n 后恢复血液再 灌流，于全脑缺血后7d 取材观察海马C A l 区锥体神经元 D N D 情况。 ( 5 ) C e f + 全脑缺血组(
14、n - 5 ) ：腹腔注射C e f , 每天一次， 共5 次；末次C e f 注射后1d 行全脑缺血8m i n ；其它同全脑 缺血组。 ( 6 ) A S O D N s + C e f + 全脑缺血组( n = 1 5 ) ：在C e f + 全脑 中文摘要 缺血组的基础上，于第一次注射C e f 后3 6h 、7 2h 以及全脑 缺血手术前1 2h 右侧脑室注射G L T - 1A S O D N s 双蒸水溶液 1 0p l ，分为9n m o l 和1 8n m o l 两个剂量；其它同全脑缺血组。 同时设R O D N s ( 1 8n m 0 1 ) 对照组( n - 5 )
15、。 以上各组均以硫堇染色法观察大鼠海马C A l 区D N D 情 况，确定组织学分级( h i s t o l o g i c a lg r a d e ，H G ) 和神经元密度 ( n e u r o n a ld e n s i t y , N D ) 。 结果：S h a m 组大鼠海马C A l 区锥体细胞排列整齐致 密，无细胞缺失。C e f + s h a m 组和A S O D N s 对照组的大鼠海 马C A l 区组织形态与s h a m 组基本一致。全脑缺血组大鼠海 马C A l 区D N D 明显，H G 显著升高，N D 显著下降( 尸 O 0 5 ) 。 C e
16、f + 全脑缺血组海马C A l 区D N D 不明显，与全脑缺血组相 比，H G 明显降低，N D 明显升高( 尸 O 0 5 ) ，表明C e f 具有 抗全脑缺血引起的D N D 的作用。与C e f + 全脑缺血组相比， A S O D N sl8n m o l + C e f + 全脑缺血组大鼠海马C A l 区D N D 明 显，H G 显著升高，N D 显著下降( 尸 O 0 5 ) ，而9n m o l 的 A S O D N s 和R O D N s 对C e f 抗全脑缺血引起的D N D 的保护 作用无明显影响。 2C e f 增加大鼠海马C A l 区G L T - l 对谷氨酸的摄取 动物分组与方法：将8 0 只凝闭双侧椎动脉的雄性 W i s t a r 大鼠( 2 7 0 3 2 0g ) 随机分为5 组： ( 1 ) s h a m 组( n = 1 0 ) ：行全脑缺血的s h a m 手术，于s h a m 手术
