《侧耳纤维二糖水解酶基因的克隆与表达研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《侧耳纤维二糖水解酶基因的克隆与表达研究（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、食用菌 全国第六届食用菌学术研讨会论文集 2 0 0 l ( 增刊， 侧耳纤维二糖水解酶基因的克隆与表达研究 扬国良李丽挪陆师义艾福彪杨秀琴 ( 河北大学生物技术中心保定0 7 l 0 0 2 ) 摘要：p D L l 是能够转化细前和真茁的双功能瞳粒将 p D l 1 与糙皮侧耳【P 打“m f w ”a 蛐J 的D N A 片段连接 然后转化玉米黑耢苗( u “i ，“g “，拈) 的原生质_ l 奉通过新 霉誊琏择平皿的筛j 盎转化率达到8 0 0 转化于p g D N A 建 立丁糙盘伽耳的基因文库随机取15 个转化于进行点渍怯 n 。u i “gb l o t t i 咄) 植验结果
2、均星阳性此结果表明抗性 克障不是螺于玉米黑粉茁敬感细胞的回复突变萨慎法 s o u t h t r nb I o t t i “R ) 检验显示车研究在玉米磊柑菌细胞中 克鹿植皮帕耳纤维= 糖水解酶基因是成功的基因表达试 齄表明玉米纛粉商克窿株具有植皮倒耳纤雄二糖水解酵 的活性 差堋t 植皮侧耳；玉米黑粉茁纤维二糖水解酶；基因克 隆 应用基因工程技术研究食用菌纤维索酶系的基 因克隆与表选，首先要建立一套有效的基因转化系 统。玉米黑粉苗和糙皮侧耳都是担子菌，但前者营寄 生而缺少纤维索酶系因此可作为糙皮侧耳纤维索 酶基因克隆的受体菌株= 】。o 。在实验室条件下玉米 黑粉菌能在基本培养基上生长，并
3、分为单倍体和双 倍体两个生长耕。单倍体的吠生孢子在培养基上似 酵母状生长易于操作。因此，长期以来人们把它作 为遗传学研究的一种理想材料“_ 】。在国内外同类 研究中本研究首次成功地在玉米黑粉菌中建立了 糙皮侧耳的基因文库，并克隆和表达了糙皮蜘耳的 纤维二糖水解酶基因 1 材料与方法 1 - 1 菌种殛主要试剂 基因供悻菌：糙皮侧耳，P 3 3 基因受体苗：玉米 _ 甓I 粉菌从玉米病株上分离对新霉素敏感i 质粒苗 体( E c 0 1 IH B I O l 】：含双功能质粒p D L l 可在细菌 和真菌之间穿棱运载D N A 。上述菌种均由中科院微 生物所提供 H o I l - d a y
4、 完全培养基：用于玉米黑粉菌禳体培 养和原生质球再生培养 限制性核酸酶 B e o l l r i n g e rM a n n h e i m 公司产 品- 真菌溶壁酶：广东微生物研究所生产；聚己二 醇一4 0 0 0 ：s j g m a 公司产品 青霉索及新霉宗中国 卫生部药物检定研究所标准品；电泳、层析所用试剂 分别酌自美国P r o m e g a 公司、s l g n l a 公司 试剂盒： P r i m e g a G e n eL a b e I j “gs y s t e m 购自美国P r o m 8 9 a 公司；同位紊：( 一3 2 P d A T P 、( 一3 2
5、 P d C T P 均为 S i g m a 公司产品。 硝酸纤维滤膜，S i g m a 公司产品Fx 一光片：日 本F U J rF i I mc 。L T D 产品 探针：李氏术霉( T r i c h o d e r m ar e e s e i ) c B HI ： 5 端E c o Rl H i n d l 片段3 4 b p ；3 端B a m HI E c o R V 片段4 8 0 b p ；李氏木毒( T r i c h o d e r m a r e e s e i ) C B HI ：s 端x b aI A v aI 片段3 5 b p 3 端A c c I H 眦_
6、 片臣4 5 0 b p 上述探针均为s I 窖m a 公司产品1 2 技术路线以p D L l 质粒为载体，玉米 黑粉菌为受体，克隆糙皮侧耳纤维二糖水解酶c B H I 基因的技术路线如图l 所示 2 结果与讨论 2 1 p D L l 质粒载体的性质 p D L I 是p u c l 2 的衍生质粒古玉米黑粉菌热休 克基因( h 3 9 7 0 ) 的启动于和终止子此外还有两十 选择标记在细菌中表达抗青霉素基因( a m o r ) ，在玉 米黑粉茁中表达新霉謇肆酸转移酶基因( n e u r ，) 目 此该质粒载悻具有在细菌与担子营之间穿校表选 魄特性。本研究成功地将该质粒用干糙皮侧耳纤
7、维 二糖水解酶c B H I 基因的克隆，解决了食用苗基因 工程研究中难眦拽到合适载体的技术难题 2 2 转化子救与特定基目奇寸竞奠 在设有新霉素的非选择性再生墙养基上，原生 质体的再生率为6 0 “一8 0 I 而经水低渗处理的原 生质体再生率小于o 0 1 在古有新霉素的再生培 养基上筛选转化子，转化事为8 0 0 一1 0 0 0 十转化子 f l g D N A 由此成功地在担子菌中构建了髓皮棚耳的 基因文库文库容量达3 1 0 个转化子侧耳的基 因组D N A 长度约为l l o 自b p ；车研究用内切酵消化 - 本研兜获得璃典自捕科学基盒厦河北省自然科学基盘的资助，特此致谢 1
8、0 4 - 用曹 垒国第六屉食用菌学术研讨会论文集 2 l ( 增刊) 后的侧耳D N A 长度平均为1 6 l o p 1 ) | ) | l I I | M n 呲巾口 M P 。5 f ，e a f “5 1 ) K A 一一一一一一v j l l w I l 炉n 一一一一 J l t 俩世_ 【l k 川l t h p k 掣1 m t m u V a l 、。c 讣离 1 m j 叭l l n iT 1 ) N A j i J 盎眦 0 卜一一一一1 ju N A 1 j g a 1 雌 舳披顷 j C a l n gp l a i d 0 九喙l 肖株 n c u rc 1 9K
9、 【m m r j 浈江 l 卜D o 札l 唱b l o n l n g I 泸做“、 J 一一S 砷1 b I o n i n g 产艏筛选 I 一一一S c r c a l l 哗f b r c 眦y m c D c s I r n Is 【m l n 、 田1 技术路线 一2 8 7 8 X 1 0 十“小聃立r 卜 f I ：l j 十n 。tr 拈小加士日】 田2玉米黑舫菌转化于的斑点杂交 将以上数据代 C I a r k e ( 1 9 7 6 ) 统计公式对所建 文库进行数学分析： N = 1 n ( 【一P ) l n ( 1 一x y ) ；I n ( 1 一o 9 9 )
10、 l n l 一1 6 l O 1 1 0 8 = I n 0 0 1 l n 0 9 9 9 8 4 = 一4 6 0 5 1 7 一1 6 0 0 1 2 8 1 0 N 一9 9 “克隆任一基因所要求的重组体数 p 一从文库中可能筛选到任一基因的概率； I n 一自然对敷I x 一文库中每一克隆所音外谭D N A 的平均长 度 y 一被克盛生物的基因蛆太小 根据以上计算得知，以0 9 “的概率啼选到皮 侧耳的任何基因。理论上要求的转化于数为2 8 7 8 1 0 个本研究所获的文库容量巳达3 1 o 十转化 子说明此基因文库符音统计学要求 2 3 转化子的鉴定 斑点杂交结果显示( 田2
11、) ，被检转化子全部显示 阳性反应，证明抗性菌落的出现不是源于敏感细胞 的回复突变 s o u t h e r n 杂交结果( 图3 ) 显示，两株转化子的杂 交带各异( 图甲A 一3 与B 一3 不同) 一说明p D L I 质粒 及其所载外源D N A 整合人玉米黑粉菌染色体的位 】0 5 食用菌 全国第六届食用苗学术研讨会论文集 2 0 0 “增刊) 置不同，即重组没有同探性。否则，转化子均应显示 相同的杂交带。 圈3s o u | h e r n 转移殛转化子放射性 自显影分析结果 A l 标准分子量对照：x 嚆苗体D N A 经H I n d I 酶解； A2 转化子P u 一5 3
12、 的D N A 经HL 【l d I 酶解； A3s o u t h e r n 转移并与3 2 P 标记的李压木霉c B Hl 荽因 探针杂交； BI 标准分子量对照： 噬茁体D N A 经H i n d I 酶解； B2 转化子P u 2 的D N A 经H ；甜I 爵解 B3s o u t h e T n 转穆井与”P 标记的李氏木霉c B H 】基因 探针杂交。 24 克睦基因的表达 经过初筛和复筛获得2 株产酶性状稳定的菌 株P U 一5 3 和P U 一4 2 ，它们可在C M C 酶诱导条件 下分泌纤维二糖水解酶振荡培养4 0 一6 0 h 后t P U 一 5 3 的酶话水平_
13、 选4 s 腿m 】 P U 一4 2 达3 5 雌m I j 而 玉米黑粉蓖对照则基本不具酶活性( 图4 ) 。此结果说 明，糙皮侧耳的纤维二糖酶基因在受体玉米黑粉菌 中得到了克隆并表达。 1 0 6 砖埘致( h 】s h jk P m ef h 围4 转化菌株的产酶状况 对照；玉米黑粉茁原株转化株：N o 4 2 ；转化株N o ：s 3 参考文献 lB a “sG R 1 h n s f 咖a t i o no fU s t l l 驴u y d bb yap l a s m j dc o 力t a 【n i “gy e a s t2 一m i c r o nD N A C u r r
14、 e n tg t i c s ， 1 9 8 3 7 l7 3 7 7 2B a n k sGRC h r 。m o s o I T I a 【D N As 。q u e n c e sf r 。mU 日t i 】8 9 。 m 8 y d i 5p t e u 【o 删s r e p 【c a t l fp 【l dI ns a c c b a y t 州e r e v i sC u r r e n g e 呲t i c s ，1 9 船7 ：7 9 8 4 3K m i 盹E B H 0 m o l o g o u sp a i r i “g 。fD N Am o 【e c u 】e s
15、b y U s “1 8 9 。R e c l p r o t e i ni 8p r o m o 【c db ys 。q u e n c e s 。fZ D N A C e l l 1 9 8 6 4 4 ：5 4 5 55 4 4S a m b r o o kJ M o j e c u 【a r c l 。n j n gaI a b o m 【。r y 眦n u a lC 。l d S p r I “EH a r b 。rP r t s s US A 1 9 8 9 2 7 3 2 8 5 5T u s k u d aTl s o l a t i n dc h a r a c 沁r i ；a t i o no fa n u t o n 。m 。u s 】yr e p 【l c a t i “Es e q u e n c cf r 。mU s u 【g o “m y d l s M o lC e I 】B i o I 1 9 8 8 B ( 9 ) 3 7 0 3 3 7 0 9 6T u 。g 啪B G 【k v e 【0 p r n 亡n to ff u o g a I t f a D s k r m 矗t i y s 一 t mb a s e do ns c
